不同蛀秆螟虫线粒体COI基因的种间变异开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（coⅠ）基因作为动物物种鉴定的条形码序列具有很多优势: (1)大多数细胞中都有上百个以上的线粒体，每个线粒体都有一组染色体，因此等量的样品中线粒体dna比细胞核dna更容易被放大和使用；(2)线粒体dna的突变速度是核dna的10倍，利用线粒体dna更容易识别物种的变异；(3)线粒体属母性遗传，很少发生基因重组； (4) 动物生命中绝大部分阶段都存在明显的coi基因序列，coi基因和其他蛋白编码基因一样，其密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异； coi不仅具有足够的变异信息，同时又有较好的序列保守性，很容易被通用引物扩增；很少存在序列插入和缺失现象，使序列比对容易操作；拥有较多的系统发育信号。

已有报道表明，利用线粒体条形码技术对不同类群昆虫的种，甚至种下类群均可以进行有效的鉴定。潘程莹等 (2006) 探讨了coi基因作为dna条形码在识别蝗虫物种方面的可行性。hebert等（2003）利用coi基因序列对鳞翅目200多个种进行了成果的鉴定。ball和hebert（2005）应用630 bp coi基因序列研究蜉蝣目昆虫，证明dna条形码可以有效地区分蜉蝣目昆虫。favret和voegtlin（2004）用小片段coi基因序列成功鉴定了形态学上难以鉴别的五节根蚜族(fordini) 蚜虫的次生寄主。foottit 等（2009）利用658 bp的coi序列片段对球蚜科17个种的不同形态、不同寄主和不同生活周期的样品进行区分，不仅揭示了分类群内隐存的多样性，同时表明dna 条形码可以很好地解决蚜虫多型性造成的形态学问题，解决昆虫幼期及多型性昆虫种类鉴定的难题。褚栋等（2005）利用coi基因片段对烟粉虱的生物型进行了鉴定。姜帆等（2011）基于 dna 条形码对广西南宁地区苦瓜中的实蝇幼虫进行分子鉴定。

蛀秆螟虫是以蛀秆方式危害禾本科植物的鳞翅目害虫，稻田中经常发现的除了水稻螟虫（二化螟、三化螟、大螟和台湾稻螟）外，还有稻田禾本科杂草上的蛀秆螟虫。目前不同文献记载的中国稻田蛀秆螟虫有17种之多，它们的栖境、形态和危害方式类似，且田间调查常遇到的是幼虫和蛹，因此鉴定虫种是大田准确监测和虫情预报的关键。过去就曾将列点大螟sesamia uniformis dudgeon误定为列星大螟sesamia vuteria (stoll)（吴荣宗，1981），近期也有将台湾稻螟误做二化螟的案例。因此，本研究在已经分析了不同地理种群的二化螟和不同寄主上大螟样本的种内变异，继续研究不同蛀秆螟虫coi基因的种间变异，以便为建立蛀秆螟虫的建议分子鉴定技术条形码技术奠定基础。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标: 建立螟虫的简易分子鉴定方法，揭示不同蛀秆螟虫的种间和种内的遗传变异度。

研究内容: 通过克隆二化螟、台湾稻螟、芦苞螟、甘蔗条螟、大螟、三化螟和玉米螟等7种常见蛀杆螟虫的coi基因，进行序列比对和遗传距离分析。

拟解决的关键问题：设计克隆不同螟虫co1基因的通用引物，并建立稳定的pcr扩增条件。

3. 研究的方法与方案

1) DNA的提取

采用QIAGEN DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒提取总DNA

2) PCR扩增

扩增引物参考Folmer所使用的LCO-1490 和HCO-2198 (Folmer et al, 1994)。

上游引物LCO-1490（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3')

下游引物HCo-2198 （5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3')

使用 rTaq 酶进行PCR反应：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min。循环39次，最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。1.5%琼脂糖电泳鉴定PCR产物，EB染色，紫外灯下观察电泳结果，利用Gel Doc2000凝胶成像系统拍照保存。

3) PCR产物的克隆测序

PCR产物经回收和纯化后，与T3载体进行连接。经转化后挑取重组质粒经菌液PCR检测后，取适量送至上海Invitrogen公司进行测序，使用的仪器为ABI3730测序仪。

4) 序列分析

将测序结果导入DNAStar 中的SeqMan 软( Parchman et al.，2010) ，进行序列的拼接与手工校正，确定分析的序列，利用NCBI 中的BLAST软件进行相似性检索，确定序列方向及目的片度; 将确定的序列载入Clustal X 1.83 软件( Chenna et al.，2003) 进行序列比对，输出格式为FASTA。比对结果导入Mega 5.0 软件( Kumar et al．，2008) ，计算各物种间的遗传距离，转换和颠换值及其比值( R值) ，保守位点( conserved sites，C) 及变异位点( variable sites，V) 等数值; 同时，利用Mega 5.0 构建基于Kimura2-parameter 遗传距离模型的邻接法( Neighbor-Joining，NJ) 系统发育树。

技术路线：

采集鉴定不同蛀杆螟虫---通用COI基因片段引物设计---螟虫的COI基因片段克隆---序列分析---明确不同蛀杆螟虫之间的变异度

可行性分析：

COI基因不仅具有足够的变异信息，同时又有较好的序列保守性，很容易被通用引物扩增；很少存在序列插入和缺失现象，使序列比对容易操作；拥有较多的系统发育信号，因此用该基因序列来分析不同蛀杆螟虫之间的变异度是可行的。

4. 研究创新点

与传统的分类鉴定技术相比，DNA条形码技术具有显著的优势。首先是操作简单，一般可以进行仪器操作的非分类专业人氏，都可以通过该技术进行物种鉴定，这在一定程度上缓解了分类学家和专业生物鉴定人才缺乏的危机；其次是不受个体发育阶段、形态特征变异和样本完整性的限制，只要能够获得完整的目标DNA片段，就能满足鉴定需求，由此进一步扩展了物种鉴定领域的广度与深度；第三是该技术可以帮助传统分类学家修正以往的分类结论，解决多态性、隐存种等形态分类无法解决的难题。

5. 研究计划与进展

2013.8-2013.11

采集不同的蛀杆螟虫，进行dna提取，克隆，测序。

2013.11 -2014.3