PCV2在牛奶、牛肉和牛排泄物中的分子流行病学调查开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒2型（porcing circovirus type 2, pcv2）是国际病毒分类学会第六次病毒分类报告的新增病毒科，最初只是作为猪肾细胞等的污染物而首次发现，此后该病毒在世界范围内广泛传播，目前该病毒更是成为影响各猪场经济损失的主要原因，该病毒基因型遗传上存在变异的情况，在各大猪场均有感染的可能。

近年来，关于pcv2病毒的遗传变异越来越多，目前世界也检测出啮齿类动物、牛体内感染该病毒，已经在犊牛患牛新生儿全血细胞减少症中发现了该病毒。德国研究表明，该病毒在犊牛体内影响较大，已发现两株毒株的存在，分别来自小牛血液和肺与大脑，李琳琳等在美国旧金山进行流行病学调查时在牛肉中发现该病毒，并且获得全基因序列。

目前pcv2病毒主要发生在猪体内，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，同时与猪呼吸道疾病综合征、猪皮炎与肾病综合征、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等密切相关，其中断奶仔猪多系统衰竭综合征影响最为严重，为各大养猪场造成了严重损失。该病毒在牛等体内虽然有发现，但发现的比较少，暂时未引起广泛关注，本研究通过对该病毒在牛体内的流行病学调查，来研究该病毒对牛的影响。

2. 研究的基本内容和问题

本研究希望通过对江苏数个集约化养牛场的随机采样来调查江苏地区PCV2病毒在牛体内的流行病学情况，主要采集牛奶、牛肉、牛下水道排泄物样本，提取该样本的DNA通过聚合酶链反应（PCR）技术来临床检测，根据GenBank中的PCV2序列设计一对引物来扩增，得到阳性结果连接到PMD19T载体上，转化到大肠杆菌体内，在听过酶切鉴定，获得的阳性结果进行测序，将测序获得的结果与参考序列进行比对分析。

3. 研究的方法与方案

本研究通过聚合酶链反应（pcr）来对采集到的样品进行临床检测，比起传统的实验室诊断方法，聚合酶链反应不仅操作简单容易把握，而且具有良好的敏感性和特异性，已经用于多种病原体的检。

样品采集时分不同区域、不同时间、不同样品、这样可使最终实验结果误差减小，更为准确地代表江苏地区pcv2病毒在牛体内的情况。

获得的样品提取dna，通过genbank中保存的pcv2序列设计一对引物，通过pcr扩增目的片段，对pcr产物进行琼脂糖凝胶实验，结果为阳性时里面即含有pcv2的目的片段，对该凝胶进行回收获得pcr产物，再以该pcr产物为模板进行pcr纯化，连接pmd19-t载体后进行转化酶切鉴定，鉴定结果为阳性的质粒进行测序，将测序结果与pcv2参考序列进行比对。

4. 研究创新点

目前世界上关于PCV2病毒的研究有很多，不管是基因型，分子学还是流行病学都广为引起关注，然而对PCV2病毒的研究多是针对猪的，由于其他动物大规模感染该病毒的报道暂未出现，因而对该病毒在牛等动物体内的调查颇为稀少，所能获得的文献等资料也较为稀少，笔者认为，不仅PCV2病毒在猪身上的调查需要关注，在其他动物（例如牛等）身上的情况也需要调查关注，近年来该病毒遗传学变异越来越多，往后出现在在其他动物身上的情况也会增多，笔者认为，该调查实在很有必要。

通过聚合酶链反应来对PCV2进行临床检测不仅操作简便易于掌控，而且敏感性和特异性还非常好，用该实验室诊断方法来测定，结果更为准确。

5. 研究计划与进展

本调查研究初期前往江苏各大养牛场进行采样，后提取dna进行聚合酶链反应实验室诊断，获得阳性结果再次经过pcr纯化，酶切鉴定为阳性则测序。

在研究中期，仍需要采集不同时间的样本，以此获得不同时间的样本，使最终结果更为准确。

目前已经获得初期样本，研究已经开始，在后期经过多次重复取样研究可能获得阳性结果，对阳性结果进行进一步调查诊断。