法氏囊源蛋白CBL的克隆及表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：cbl(casitas b-lineage lymphoma)是一类广泛分布的细胞内蛋白,属于泛素连接酶e3,由n-端保守的tkb和ring结构域以及其它蛋白-蛋白结合模体组成。

病毒感染可以激活宿主的免疫系统,包括天然免疫防御系统和获得性免疫应答防御系统。

其中，天然免疫反应主要发生在病毒感染的早期且与抗病毒感染紧密相关。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：通过大肠杆菌原核表达及bhk细胞真核表达，获得有生物活性的cbl。

研究内容：1.目的基因的获取提取dt40(dt40是从禽白血病病毒引起的传染性法氏囊淋巴瘤在白来航鸡衍生的b细胞系)总rna ,然后反转录出cdna，以此为模板通过pcr扩增出所需的目的基因。

2.原核（真核）表达载体的构建将目的基因与表达载体（原核为pet28a和pet32a，真核为egfp与flag）进行双酶切，酶切后产物经过dna连接酶连接获得原核（真核）表达载体。

3. 研究的方法与方案

研究方法：试剂盒提rna、rt-pcr、核酸凝胶电泳、核酸胶回收、dna酶切与连接、普通提质粒与去内毒素提质粒、转化、转染、蛋白诱导表达、蛋白电泳等技术路线：1.目的基因的获取提取dt40(dt40是从禽白血病病毒引起的传染性法氏囊淋巴瘤在白来航鸡衍生的b细胞系)总rna ,然后反转录出cdna，以此为模板通过pcr扩增出所需的目的基因。

4.原核（真核）表达载体的构建将目的基因与表达载体（原核为pet28a和pet32a，真核为egfp与flag）进行双酶切，酶切后产物经过dna连接酶连接获得原核（真核）表达载体。

5.目的蛋白的表达和纯化将原核（真核）表达载体导入到感受态细胞（bhk细胞），筛选出阳性克隆并测序，测序正确的阳性克隆进行目的蛋白的诱导表达，通过超声破碎和蛋白电泳技术获得目的蛋白，并进行进一步纯化。

4. 研究创新点

泛素连接酶是目前国内外的研究热点，通过原核及真核系统表达出有活性的CBL蛋白，为进一步动物实验探究其抗病毒感染的作用奠定基础。

5. 研究计划与进展

第一阶段：2015.92015.10熟悉实验室操作与论文课题，积极查阅相关资料做好充足的技术准备和知识储备。

第二阶段：2015.102015.11完成原核表达载体的构建。

第三阶段：2015.112015.12完成原核表达及蛋白纯化、真核表达载体的构建。