猪链球菌新血清型荚膜多糖提取分离与纯化及组成研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪链球菌为兼性厌氧的革兰氏染色阳性菌，呈球形或卵圆形，常呈链状排列的短链结构。菌落小，直径0.5-1.0mm，半透明略带灰白色，周围有轻微溶血环[1]。猪链球菌的定植部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔，可引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎和急性死亡等，暴露于病（死）猪及其生肉制品的人员同样可以感染猪链球菌，发病后出现化脓性脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎，伴有耳聋、运动功能紊乱等临床症状，严重的病例发生中毒性休克综合症，导致多脏器衰竭及死亡[2]。自丹麦在1968年最早报道人感染猪链球菌病后，北欧和东亚、东南亚部分国家均报道过猪链球菌病例，以散发性病例为主[1]。

猪链球菌的致病因子有荚膜、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子、溶血素。其中，荚膜重要的致病因子，是某些细菌在其生活过程中在细胞壁的外周产生的一层包围整个菌体、边界清楚的粘液样物质。荚膜具有保护细菌的功能，可抵抗动物吞噬细胞的吞噬和抗体作用，从而对宿主具有侵袭力。荚膜也常是营养物质的贮藏和废物的排出之处[3]。此外，游离的荚膜多糖还能刺激幼猪产生具有调理作用的抗体，用弗氏不完全佐剂可提高其免疫原性[4]。综上可知，荚膜多糖对猪链球菌来说是一种非常重要的致病因子。其可能的作用机理是帮助菌体抵抗吞噬细胞吞噬及影响细菌与上皮细胞的黏附[5]。荚膜最低厚度0.2μm，有相当大的外部表面，含水量很大，经脱水和特殊染色后可在光学显微镜下看到。在一般实验室中，可利用荚膜能排斥微细炭粒的特点而方便地用碳素墨水对产荚膜菌进行染色（背景染色），以方便观察[6-7]。

荚膜多糖有抗吞噬活性，在猪链球菌致病过程中发挥重要作用，因此，不少学者正努力探索预防这些疾病的途径，以荚膜多糖为基础的疫苗研制工作正在展开[8]。目前对猪链球菌荚膜多糖的研究主要集中在血清2型上，对其它具有致病性的猪链球菌研究并不多，特别是对其分离纯化和结构分析方面的研究报道尚不多见[9]。本文采用硫酸一苯酚法、高效凝胶渗透色谱法和柱前衍生高效液相色谱法等对新型猪链球菌分离株的荚膜多糖组成与结构进行较为系统的分析研究，以期对以荚膜多糖为基础的疫苗研制提供更多的线索和依据，进而推动未来多价疫苗和结合疫苗的发展。

2. 研究的基本内容和问题

包被在病原菌外的荚膜多糖是病原菌主要的保护性抗原，它可以保护其免于吞噬细胞的吞噬并影响细菌与上皮细胞的黏附，从而导致病原菌对受感染者的进一步侵袭，其致病能力与荚膜多糖有关。故本试验拟提取分离和纯化新型猪链球菌分离株荚膜，采用酶解法和钙盐分步沉淀法分别脱去荚膜粗多糖中的蛋白和核酸，并采用硫酸-苯酚法、高效凝胶渗透色谱法和柱前衍生高效液相色谱法等对其荚膜多糖组成与结构进行较为系统的分析研究，以期对以荚膜多糖为基础的疫苗研制提供更多的线索和依据，进而推动未来多价疫苗和结合疫苗的发展。

研究内容：

1.荚膜多糖的提取

3. 研究的方法与方案

研究方法：

本试验拟提取分离和纯化新型猪链球菌分离株荚膜，采用酶解法和钙盐分步沉淀法分别脱去荚膜粗多糖中的蛋白和核酸，并采用硫酸-苯酚法、高效凝胶渗透色谱法和柱前衍生高效液相色谱法等对其荚膜多糖组成与结构进行较为系统的分析研究，以期对以荚膜多糖为基础的疫苗研制提供更多的线索和依据，进而推动未来多价疫苗和结合疫苗的发展。

技术路线：

4. 研究创新点

1.本试验所用的菌株为临床分离的新血清型菌株。

2.目前进行细菌荚膜多糖相关研究的较少，且荚膜多糖对于推动未来多价疫苗和结合疫苗的发展具有重要作用。

5. 研究计划与进展

1.试验准备阶段：（9月01日-9月15日）试验相关试剂、仪器准备

2.预试验：（9月16日-9月30日）荚膜多糖提取分离及纯化

3.荚膜多糖提取分离及纯化：（10月1日-10月20日）