猪圆环病毒2型双夹心ELISA抗原检测方法的建立与应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

近年来，pcv2的感染越来越普遍，给国内外养猪业造成严重的经济损失^[1,2]。因而，建立高效的预防和诊断方法对该病毒的综合防治具有重要意义。目前关于pcv2

感染诊断的方法主要包括病毒分离、ipma^[3,4], ifa^[5], pcr^[6], elisa^[7-11]等，其中ifa和ipma敏感性高、特异性好，是检测pcv2抗原抗体的经典方法，但其操作耗时费力，对技术和设备要求高因此无法推广应用。而elisa方法^[9]具有操作简便、敏感性高、一次检测样本多、易标准化等特点，已成为常规诊断试剂的首选。目前国内外已经有商品化的pcv2抗体检测elisa试剂盒，但对于pcv2抗原诊断的elisa试剂盒研究尚且缺乏。本研究利用pcv2的单克隆抗体和兔抗血清，成功建立一种检测pcv2抗原的双夹心elisa方法，为pcv2的抗原检测提供一种有效工具。

参考文献

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：猪圆环病毒2型能用双夹心elisa抗原检测方法检测出来，且特异性强、灵敏度高、重复性好、保存周期长，比其他检测方法效果好。

研究内容：筛选最佳单抗、单克隆抗体最佳包被浓度、多克隆抗体最佳稀释度、单抗最佳包被时间的选择、封闭液与封闭时间的选择、抗原稀释度与作用时间的选择、兔抗血清作用时间的选择、酶标抗体浓度与作用时间的选择、显色时间的选择等。

拟解决的关键问题：单克隆抗体、多克隆抗体、阴阳性检测样品的制备、双夹心elisa检测方法的建立。

3. 研究的方法与方案

研究方法：用腹水纯化法制作单克隆抗体、多克隆抗体，采用方阵滴定法测出最佳单抗、单克隆抗体最佳包被浓度、多克隆抗体最佳稀释度、单抗最佳包被时间、最佳封闭液与封闭时间、最佳抗原稀释度与作用时间、最佳血清作用时间、最佳酶标抗体浓度与作用时间、最佳显色时间。

腹水纯化法制作单克隆抗体、多克隆抗体

技术路线;

采用方阵滴定法测出最佳单抗及显色时间

采用方阵滴定法测出单克隆抗体最佳包被浓度、多克隆抗体最佳稀释度

采用方阵滴定法测出单抗最佳包被时间、最佳血清作用时间

采用方阵滴定法测出最佳抗原稀释度与作用时间

采用方阵滴定法测出最佳封闭液与封闭时间

采用方阵滴定法测出最佳酶标抗体浓度与作用时间

采用上面测出来的最佳反应条件做双夹心ELISA，设立阴、阳性对照及空白对照孔测灵敏度

用测出来的最佳反应条件做双夹心ELISA同时检测PCV2,PCV1,PEDV, PRRSV,EMCV,PCMV，分析该方法是否与其它猪病的病原有交叉反应性

采用上面测出来的最佳反应条件做双夹心ELISA，测批内重复性和批间重复

采用上面测出来的最佳反应条件做双夹心ELISA，连续测定2个月，对本试剂盒的保存期进行评价。

实验方案: 用稀释的单克隆抗体100微升每孔包被酶标板，置37度作用过夜;甩去板中的液体，用含PBST洗板4次，每次5min，每次都拍干，加入2.5%脱脂奶粉封闭液，200微升每孔，置37℃作用1h;洗板4次，加入1:10稀释的待检抗原样品，100微升每孔，置37度孵育1h;洗板4次，加入稀释的多克隆抗体，100微升每孔，置37度孵育1h;洗板4次，加入稀释的酶标二抗，100微升每孔，置37度孵育1h;洗板4次，加入底物显色液，1 OO微升每孔，37℃避光显色l Omin;加终止液2M H₂S0₄，50微升每孔，混匀后10min内测定OD₄₅₀值。采用方阵滴定法按照上面步骤测出最佳反应条件。

阴阳性临界值的判定

检测经RT-PCR确定为病毒感染阴性的样品共104份（假如），同时设标准阳

性对照及阴性对照，经多次重复检测OD₄₅₀值，最终确定本方法的阴阳性界线判

定标准如下:

实验成立条件:

阳性对照平均OD值(PC):大于0.4 ;

阴性对照平均OD值(NC):小于0.2 ;

CPC计算方法:CPC= PC -NC;

SP计算方法:SP=(样品OD值-NC) /CPC 。

阴阳性界线判定标准:

阳性 可疑 阴性

SP0.4 0.2SP0.4 SP0.2

如果样品的检测结果落在可疑区间，则需要进行第二次检测。若第二次检测后

结果仍为可疑，则要考虑重新收集样品再进行检测。

双夹心ELISA灵敏度测定：

将抗原从1 X 10⁶倍开始稀释至1X10⁶倍，设定阴、阳性对照及空白对照孔(用灭活的病毒稀释液作为阳性对照,1%BSA的缓冲液作为阴性对照)。利用建立的双抗体夹心EI,ISA进行测定，计算方法的灵敏度。

特异性试验：

用包被好的酶标板用双夹心ELISA同时检测PCV2, PCV1, PEDV, PRRSV, EMCV, PCMV这

6种病毒及Hps，分析该方法是否与其它猪病的病原有交叉反应性。

重复性试验：

（1）.批内重复性

用纯化的同一批次的捕获抗体，于不同时间包被制备ELISA板，同时检测四份

己知背景样本，强阳、中阳、弱阳和阴性各1份，每个样本设立三个重复，计算标准

差和变异系数，分析其批内重复性。

（2）．批间重复性

用纯化的三个批次的捕获抗体，于同一时间包被制备ELISA板，同时检测四份

已知背景样本，强阳、中阳、弱阳和阴性各1份，每个样本设立三个重复，计算标准

差和变异系数，分析其批间重复性。

保存期实验：

将包被好并密封的酶标板保存于-20℃中，取出对标准阳性和标准阴性样品进行检验，并连续测定十个月，对本试剂盒的保存期进行评价。

可行性分析: 江苏农科院兽医研究所多年来一直承担国家、农业部、江苏省等科研项日，拥有先进的实验设备完成该项实验，可支持本实验顺利完成。本课题的指导老师是江苏农科院兽医研究所的，拥有这方面丰富的经验，可指导本实验顺利完成。另外本人是南京农业大学大五的学生，有大量的时间，还学过流行病学、免疫学等课，懂得这实验中所需要的技术。

4. 研究创新点

关于PCV2抗原诊断主要有病毒分离、IFA、IPMA、ICH和PCR等方法,除PCR作为检测较为快速准确外,其它几种方法则费时耗力,而且这几种方法对设备和技术要求高,投入成本大,且不能大批量检测和使用,但 ELISA方法因具有简便、快速、敏感性高等特点,已经广泛应用与临床疾病的检测,其中双夹心ELISA方法不仅能用于抗原的定性检测,还可以对抗原感染量的多少进行定量分析,因此具有重要的应用价值。

5. 研究计划与进展

2015年9月1号- 2015年9月30日：完成单抗的筛选、显色时间、单克隆抗体最佳包被浓度、多克隆抗体最佳稀释度、单抗最佳包被时间的选择。

2015年10月1号-2015年10月31日：封闭液与封闭时间的选择、抗原稀释度与作用时间的选择、兔抗血清作用时间的选择、酶标抗体浓度与作用时间的选择。

2015年11月1号-2015年11月30日：单克隆抗体、多克隆抗体、阴阳性检测样品的制备、检测双夹心elisa特异性强、灵敏度、重复性、保存周期。