猪细小病毒VP2蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪细小病毒病是由猪细小病毒（procine parvoviurs，ppv）引起，ppv为无囊膜单股线性dna病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，直径介于18-22nm之间，病毒基因组的大小约为5kb[1]。

病毒通过胎盘屏障后可以感染胚胎，是母猪障碍的主要病原之一，主要引起出产母猪的繁殖障碍和仔猪的皮肤破损等症状，临床表现为妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎、畸形胎产仔不足以及母猪不育等繁殖障碍。

[2]该病与1966年首次发现与英国，1967年cartwright等从猪流产的胎儿中分离ppv，首次证明它的致病作用。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：用纯化了的ppv的vp2蛋白进行包被，优化反应条件和体系，建立针对ppv抗体的elisa检测方法，从而达到对ppv的方便有效的监测。

研究内容：（1）引物的设计合成；（2）病毒基因组dna的提取；（3）vp2基因的pcr扩增；（4）vp2基因表达载体的构建与鉴定；（5）重组蛋白的表达与纯化；（6）重组蛋白的western-blot活性检测；（7）间接elisa诊断方法的建立（包括特异性、敏感性、重复性和比较性试验）；（8）试验的实际应用。

拟解决的关键问题：检测ppv抗体的间接elisa的建立。

3. 研究的方法与方案

研究方法：用纯化的vp2蛋白进行包被，建立猪细小病毒抗体间接elisa的检测方法。

技术路线：可行性分析：本研究使用的间接elisa技术优点突出，技术成熟，具有可行性。

且所使用的技术及仪器在普通实验室都能进行。

4. 研究创新点

目前，检测 ＰＰＶ 抗体的诊断方法主要有血凝和血凝抑制试验、中和试验等。

常规检测方法费时费 力，不 易 标 准 化，而 且 特 异 性 和 敏 感 性 不 高；ＥＬＩＳＡ 具有特异性和敏感性强、重复性高、检测速度快、易于标准化等优点，是当前动物传染病检疫流行病学调查广泛采用的血清学检测技术。

vp2 蛋白是 ppv 主要结构蛋白和免疫原性抗原，其在体外表达后，不仅具有良好的免疫原性，而且可以诱导产生强烈的免疫应答反应。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展2018年3月（1）引物的设计合成（2）病毒基因组DNA的提取（3）VP2基因的PCR扩增（4）VP2基因表达载体的构建与鉴定（5）重组蛋白的表达与纯化2018年4月（1）重组蛋白的western-blot活性检测（2）间接ELISA诊断方法的建立（包括特异性、敏感性、重复性和比较性试验）（3）临床样本的检测