CTA1-VP1 GH LOOP-DD蛋白的表达及免疫原性的初步判断开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

霍乱毒素ct是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素，具有很强的免疫原性和佐剂活性，是当今研究得最多且最深入的黏膜佐剂之一，ct本身具有很强的毒副作用，使得它的应用受到限制，至今对ct佐剂的研究仍限于动物实验，当前研究的主要目标是通过各种改造使ct具备优良的佐剂活性而没有显著的毒副作用。

佐剂是能增强抗原的免疫原性的试剂。

作为一种黏膜免疫佐剂，ct直接作用于免疫系统，提高整体的反应强度，使针对于抗原的免疫反应增强，结果相当于抗原的免疫原性得到了提高。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：CTA1-VP1 GH LOOP-DD的表达及免疫原性的初步判断 内容：（1）CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白载体的构建（2）CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白的表达（3）CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白的纯化（4）CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白免疫小鼠（5）ELISA测定小鼠血清中针对FMDV VP1蛋白抗体水平拟解决的关键问题：纯化好的重组蛋白不稳定，会出现重组蛋白4℃存放一到两天后蛋白析出，本研究在蛋白纯化透析完成后立即处理重组蛋白免疫小鼠，避免蛋白在存放过程中析出。

3. 研究的方法与方案

研究方法/技术路线：（1）将口蹄疫多肽基因片段插入cta1-dd中，构建cta1-口蹄疫多肽-dd重组蛋白表达载体（2）将构建好的cta1-口蹄疫多肽-dd蛋白表达载体转化到大肠杆菌中诱导蛋白表达（3）将表达蛋白后的大肠杆菌高压破碎，获得的重组蛋白过镍柱纯化。

纯化后的蛋白放入透析袋中用pbs溶液透析脱盐，之后测定蛋白浓度。

（4）根据蛋白浓度加入isa206佐剂免疫小鼠（5）elisa测定小鼠的针对fmdv vp1蛋白抗体水平实验方案：（1）构建cta1-口蹄疫多肽-dd重组蛋白表达载体（2）cta1-vp1 gh loop-dd蛋白的表达（3）cta1-vp1 gh loop-dd蛋白的纯化（4）cta1-vp1 gh loop-dd重组蛋白免疫小鼠（5）elisa测定小鼠血清抗体水平可行性分析：目前实验室载体的构建，蛋白的表达与纯化技术比较成熟，抗体的测定有标准的试剂盒，本次实验在技术上是可行的。

4. 研究创新点

将VP1 GH LOOP与具有免疫原性和佐剂活性的基因融合蛋白CTA1-DD结合，构建成新的重组蛋白CTA1-VP1 GH LOOP-DD，并对重组蛋白的免疫原性进行分析，检测FMDV 的抗体水平。

5. 研究计划与进展

2017年10月至11月CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白载体的构建2017年11月至12月CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白的表达2017年12月至2018年1月 CTA1-VP1 GH LOOP-DD重组蛋白的纯化2018年1月至2月CTA1-VP1 GH LOOP-DD免疫小鼠与小鼠血清抗体水平的测定