猪链球菌裂解酶PlyGBS1249的结构域功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究意义1.1猪链球菌和猪链球菌病猪链球菌(streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原菌,能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎、多发性关节炎和多发性装膜炎等；该菌在特定情况下也能感染人,引起人的急性败血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病[1]。

猪链球菌病呈世界性分布。

目前,美国、荷兰、英国、加拿大、澳大利亚、新西兰、比利时、巴西、丹麦、挪威、芬兰、西班牙、德国、爱尔兰、中国(包括大陆、香港和台湾)、日本等几乎所有养猪国家和地区均有发生猪链球菌病的报道,这不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,同时还对公共卫生尤其是相关从业人员的健康构成严重威胁[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标1.1表达和纯化猪链球菌裂解酶三个结构域蛋白，并进行特性分析（包括酶学性质分析、裂解谱的构建、电镜观察）1.2对裂解酶细胞壁结构域的功能进行分析，获得关键氨基酸位点。

2.研究内容2.1裂解酶各个结构域的表达与纯化针对裂解酶各个功能结构域（酶活结构域、细胞壁结合结构域）的序列的orf设计表达引物，使用高保真dna聚合酶扩增片段，用双酶切法，只保留c端组氨酸标签（试验证实n端组氨酸标签干扰裂解酶的酶活性区域的正确折叠，导致重组裂解酶失去抑菌活性），连接至pet或含有gfp蛋白的质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞中进行表达。

将采用低iptg浓度和低温等诱导表达方式，尽可能地使目的蛋白有活性地表达在上清中。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法及可行性分析构建重组质粒、目的蛋白克隆表达与检测、构建裂解谱、裂解酶细胞壁结构域的功能分析。

导师课题组自上世纪九十年代起就开始专注于链球菌的研究，具备细菌病原的分离鉴定、蛋白表达纯化以及免疫血清学检测等各方面技术条件。

同时还拥有蛋白组学分析平台和生物信息学分析平台，已系统地对猪链球菌（s. suis）、无乳链球菌（s. agalactiae）、鸭疫里氏杆菌（riemerella anatipestifer）、禽源大肠杆菌（e. coli）等重要的动物细菌病病原进行了蛋白组学分析，具有扎实的实验基础。

4. 研究创新点

1.在项目设计方面，不是重复以往的工作，而是以导师课题组前期工作为基础，以酶学性质分析和裂解谱试验确定裂解酶的各个功能结构域的作用，进行横向比较，避免了不同条件下所表达的目的蛋白的差异性对裂解效果的影响。

2.本项目选题，切合了我国猪链球菌病急需防治的实际需求，同时有较强的针对性和公共卫生学意义。

此外，猪链球菌病的防治主要依赖于抗生素，而抗生素的使用会发生药物残留，导致食品安全等一系列严重问题，本项目选题从实际出发，通过对裂解酶不同功能结构域的研究，为猪链球菌病的防治提供新的途径。

5. 研究计划与进展

第一阶段（2017.92017.10）学习实验室操作规范，完善实验设计、熟悉相关操作。

第二阶段（2017.112017.12）完成针对裂解酶各个功能结构域（酶活结构域、细胞壁结合结构域）的序列的orf设计表达引物，诱导表达，使目的蛋白尽可能表达在上清中，使用sds-page检测纯化效果。

第三阶段（2018.22018.5） 确定是何种结构域起最为重要的作用，确定重组蛋白的最佳使用浓度、最适温度、最适ph值。