猪传染性胸膜肺炎放线杆菌RTX蛋白和OMP外膜蛋白的可溶性表达与纯化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（actinobacillus pleuropneumoniae，app）是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原，胸膜肺炎放线杆菌属于巴氏杆菌科、放线杆菌属，是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜和菌毛，不形成芽孢，其毒力因子为主要的免疫原。

猪传染性胸膜肺炎是一种具有高度传染性的呼吸道病,世界各国均有发生,给世界范围内养猪产业造成了巨大的经济损失。

app至今较为公认的有15种血清型并且有很多毒力因子可以引起动物发病,包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白(outer memberancprotein,omp)、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子及溶血素等。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本研究通过构建了apx基因和omp基因的原核表达载体经转化dh5α感受态细胞后，进行诱导表达与纯化，为构建检测猪传染性胸膜肺炎感染的抗体检测方法和开发亚单位疫苗奠定基础。

研究内容：①rtx蛋白和omp外膜蛋白诱导表达条件。

②rtx蛋白和omp外膜蛋白纯化条件。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法：将重组质粒和空白载体分别转化感受态细胞中，并涂抹于含氨苄抗性的培养基中，置于37℃恒温箱中培养12小时，挑取培养基中的单菌落接种于含氨苄抗性的lb液体培养基中，置于37℃振荡培养约od600达到0.6至0.8时，加iptg至终浓度为1.0mmol/l，继续培养24h后获得表达。

将收集于管中的细菌离心弃上清，加pbs吹散混匀，重复两到三次，反复冻融两到三次，超声裂解使细胞破碎，12000rmp离心5min，加入适量sds凝胶加样缓冲液，之后沸水浴10min，表达产物用sds-page和western-blot进行蛋白表达检测。

技术路线实验方案：将目的基因载体通过阳性转化的感受态细胞摇菌，涂板→挑选菌落接种lb培养液，诱导蛋白表达→sds-page与western-blot鉴定蛋白是否表达→若表达，则超声裂解表达菌，进行可溶性检测，确定目的蛋白在上清或包涵体中，纯化蛋白；若未表达，则筛选诱导条件，重复试验，直至蛋白表达并纯化蛋白。

4. 研究创新点

通过原核表达实验对流行的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌RTX蛋白和OMP外膜蛋白可溶性表达与纯化，为开发重组亚单位疫苗奠定基础。

5. 研究计划与进展

2017年12月至2018年4月A．查阅资料，确定实验详细计划；B．摸索原核表达诱导条件，并对表达产物进行检测；C．对确定的表达产物进行大量纯化。

D．写总结报告，进行项目验收。