1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪传染性胃肠炎 (transmissiblegastroenteritis，tge)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis，tge)引起的一种猪的急性、高度接触性传染病，以腹泻、呕吐、脱水等为主要临床特征，是近年来引起我国及亚洲其他国家腹泻病的主要病原之一，对养殖业造成了严重的经济损失。
tge的快速准确的诊断对于该病的防控十分重要。
然而目前我国尚无正式注册的商品化tge抗原或抗体检测试剂或试剂盒。
2. 研究的基本内容和问题
本实验旨在建立一种猪传染性胃肠炎病毒n蛋白抗原特异性抗体的检测方法，即常用的血清学方法之一---间接elisa其主要内容有：1.将pet-28a-n重组质粒转化至bl21感受态细胞中，37度过夜，挑取单菌落摇床培养至对数生长期，向菌液中加入iptg，诱导蛋白表达，6h后，将菌液低温离心5min，转速为12000，弃掉上清液，并将沉淀重悬，加入sds-page电泳缓冲液，煮沸10min后，进行sds-page电泳分析，若目的条带大小与预期相符，则将菌液超声破碎并进行纯化，将纯化产物转印至nc膜上，并与一抗和二抗作用，若westernblot可见一条清晰的条带，大小符合预期，则证明该蛋白具有良好的反应原性。
2.使用该重组Ｎ蛋白建立抗体检测间接elisa方法，对各组分和步骤进行优化，确定最佳工作条件,另外，将包被的重组Ｎ蛋白与pedv、prrsv、和pcv2等阳性血清发生进行血清学实验，若无交叉反应，则表明该方法具有良好的特异性；并将阳性血清浓度梯度稀释，若稀释度足够大时（1：1000以上）仍检测为阳性，表明该方法具有良好的敏感性；批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数可以表明该方法是否具有良好的稳定性；分别用间接elisa与病毒血清中和试验检测若干份临床样品，间接elisa方法的阳性检出率与病毒血清中和试验的阳性检出率二者的符合率高低可表明建立的elisa方法是否具有良好的准确性。
若建立的此方法特异性强，灵敏度高，重复性好，稳定性高，准确性强，则表明本研究建立的间接elisa可为猪传染性胃肠炎血清抗体的快速检测提供了一种可靠、准确的方法。
3. 研究的方法与方案
本研究利用传统经典的原核表达，采集病料，提取病毒rna，逆转录之后将表达该蛋白的基因组与载体pet-28a连接以构建表达载体，转化至dh5α感受态细胞并进行菌液pcr鉴定与双酶切鉴定，鉴定阳性的菌液继续转化至bl21中，加入tptg诱导其表达，并将表达产物纯化进行western blot分析其抗原性。
再将纯化的抗原包被至96孔板确定最适抗原稀释度、抗体稀释度、封闭液的浓度以及作用时间等以建立elisa方法，并应用该elisa方法检测特定血清。
技术路线：（见附件）本实验基于经典的原核表达和经典的elisa方法，构建的表达载体能够稳定表达，实验中包含了稳定性，特异性，敏感性，重复性的相关步骤，elisa方法建立时采集了较多阴性血清，增加了阴，阳性临界值的准确性，此外，实验中大量设置对照，试验方法严谨，故可行性强。
4. 研究创新点
假阳性和假阴性是间接elisa检测的两个关键因素。
为了消除这两个不利因素，本研究预设置最佳的临界值。
将od450转换成kq值，降低不同环境和温度对于检测过程的影响，使检测结果更加稳定可靠。
5. 研究计划与进展
1、猪传染性胃肠炎病毒n蛋白的原核表达。
完成2、猪传染性胃肠炎病毒n蛋白的纯化。
完成3、免疫转印鉴定纯化蛋白的免疫原性完成4、间接elisa方法的建立正在进行中，预计4月20日完成5、间接elisa方法的应用预计4月25日完成
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