翘嘴鲌微卫星多重PCR及其亲子鉴定应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

翘嘴鲌(culter alburnus)，又名翘嘴红鲌、翘嘴巴、鲌鱼、大白鱼等，属鲤科(cyprinidae)、鲌亚科(cultrinae)、鲌属(culter)。翘嘴鲌是鲌亚科中体型最大的一种，适应能力较强，广泛分布于我国黑龙江、黄河、长江、珠江等水系 ，为太湖“三宝”之一，也是中国“四大名鱼”之一。翘嘴鲌肉味鲜美，肉质细嫩洁白，营养丰富，是一种深受消费者青睐的食用鱼类^[1]。翘嘴鲌生长迅速，抗病抗逆性强，可生活在湖泊、水库和外荡等大水体中；自人工繁殖技术解决后，翘嘴鲌养殖规模不断扩大，已成为中国主要的淡水养殖对象之一。随着人工养殖业的不断发展，翘嘴鲌的产量逐年提高，在渔业经济效益提升的同时，也对翘嘴鲌种质资源的保护和可持续利用带来挑战。目前，翘嘴鲌种质资源的开发利用以长江水系、黑龙江水系为多，黄河水系较少，且存在伸张速度缓慢、死亡率高、个体规格悬殊等问题。由于翘嘴鲌较急躁，喜欢跳跃，生产过程中通过补充野生资源对亲本群体进行复壮的成本较高；生产单位主要利用成熟的养殖个体作为繁育亲本开展苗种生产；加上缺乏行业标准及推广良种，翘嘴鲌这一优质的淡水种质资源的可持续利用面临严峻挑战。目前，针对翘嘴鲌的种质保护及遗传育种研究开展还较少，主要集中于远缘杂交^[2]、群体遗传^[3]及雌核发育^[4]等方面研究。因此，系统开展翘嘴鲌的种质评估和遗传改良等相关研究，加快推进良种化进程，是促进翘嘴鲌种质保护和长久利用的有效途径。

选择育种作为动物遗传改良的有效方法，通常分为群体选择和家系选择。群体选择是开展育种的最简单的方法，在许多环境条件下可获得较快的遗传进展。但是群体选育不能区分亲子关系，无法确定特定亲本在子代群体中的贡献率，下一代群体选择的个体容易来自于少量的亲本，容易导致有效繁殖亲本减少和高度近交现象。brown等（2004）^[5]对金头鲷（sparus aurata）的研究发现，实际产卵的亲鱼数量只占使用亲本的1/3。家系选择，通过建立大量的家系可有效降低近交率和提高选择压力，但是在开展选育的过程中所需人力、财力和物力较大，对于小型育种单位来说难以实施。大量研究证明使用高度多态性标记鉴定鱼类的出身的可行性^[6-7]。针对某一种鱼通过混合产卵，可以借助物理标记和亲子鉴定技术来鉴别亲本与子代的关系，从而建立全同胞和半同胞家系。亲子鉴定方法有多种，目前应用最多的、最先进的技术是dna分子标记技术，原理是依据分子标记的孟德尔规律来判断个体间的亲子关系。微卫星标记作为分子标记具有分布广泛、多态性高、扩增效率高、检测容易及容易实现自动化标准等诸多优点。在鱼类育种中，基于微卫星标记的亲子鉴定方法在鉴别个体身份建立系谱信息方面是非常适用的^[8]。目前，已经对鲢（hypophthalmichthys molitrix）^[9]、虹鳟（oncorhynchus mykiss）^[6]、金头鲷^[10]、草鱼（ctenopharyngodon idella）^[11]、鲤（cyprinus carpio）^[12]、大西洋鲑（salmo salar）^[13]等重要经济鱼类都建立了微卫星标记的亲子鉴定方法。从这些建立的亲子鉴定体系可以看出，微卫星标记位点数从5到18不等，但是子代被正确判别的准确率很高（90.7-99.9%）。在翘嘴鲌的相关研究中，多态性微卫星标记的开发已有较多开展^[14-15]，而将其应用于家系构建及亲子鉴定等研究尚未见报道。因此，当前可以利用已开发的微卫星标记，针对繁殖过程中的亲本及子代开展亲子鉴定研究，探索人工繁育效率、亲子贡献率等翘嘴鲌繁殖生物学问题，并可为翘嘴鲌的家系选育提供基础手段。

鱼类家系选育需要构建大量的家系，需要土池发塘来提供开口饵料，消耗大量的财力、物力、人力，实施难度很大。如果采用群体选育，由于翘嘴鲌怀卵量较大，在选择过程中容易出现所选子代来自于少量的亲本，导致后期选育中发生高度近交。针对这些问题，本研究基于微卫星标记构建亲子鉴定技术，以期准确掌握翘嘴鲌选育的家系数及选择效率，从而提高选育效率并加快选育进程。

2. 研究的基本内容和问题

本项目研究目标旨在基于微卫星标记，构建翘嘴鲌的亲子鉴定技术，为翘嘴鲌家系选育过程中系谱关系的掌握和维系提供基础手段，并有助于了解翘嘴鲌繁殖生物学特征，也为后续数量遗传相关研究奠定基础，为家系选育奠定基础。

本项目主要包括以下研究内容：（1）筛选多态性高的SSR标记，摸索构建多重PCR体系（2）；通过人工繁殖技术，构建翘嘴鲌家系材料，基于以上多重PCR体系开展翘嘴鲌亲子鉴定分析，为其遗传研究及家系选育提供基础研究手段

3. 研究的方法与方案

研究方法：

多态性微卫星位点筛选，收集ncbi及研究团队前期开发的位点，基于12-24尾野生个体，筛选出50个多态性好、扩增效率高及存在扩增长度差异的微卫星位点，根据引物退火温度，片段大小，mg² 浓度，引物连锁平衡关系等，筛选12-16对杂合度高的微卫星分子标记，采用荧光标记（fam，hex）引物，借助multiplex manager 1.2软件探索多重pcr扩增，采用abi3730测序仪str分型技术获取基因型信息。利用cervus3.0等软件，根据对应的基因型频率，进行家系亲缘关系的重建模拟分析，通过模拟分析估计该方案鉴定能力。根据获得的基因型信息，通过计算lod最大值及delta(Δ)值选出最适父母，建立亲权关系。

技术路线：

4. 研究创新点

首次开展基于分子标记翘嘴鲌亲子鉴定技术，为了解人工繁殖效率、掌握繁殖群体系谱关系提供研究手段，并为翘嘴鲌数量性状的统计遗传研究及家系选育等奠定基础。

5. 研究计划与进展

2018年11月－12月 积极与老师沟通，确定正确的研究思路。积极阅读相关书籍和文献，系统的学习与本项目相关的知识，认真学习在校课程，为实验打好坚实的基础

2019年1月 确定实验所需材料和相关设备，与导师交流确定最终方案，着手准备相关的实验所需的材料以及工具，向学校申请使用需要的研究设备

2019年3月—4月 ssr引物设计以及pcr扩增验证。提交《项目中期检查表》等阶段性研究报告。