安吉白茶莽草酸脱氢酶基因克隆及序列分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

茶树功能基因组和次生代谢研究是进入后基因组时代的重要基础研究。茶叶儿茶素、咖啡碱、茶氨酸等茶树次生代谢产物是与人体健康密切相关的物质，具有广阔的应用前景。近年来，我国茶树功能基因组研究取得了较大进展，茶树次生代谢主要集中在与茶叶品质、人类健康密切相关的儿茶素、咖啡碱和茶氨酸的代谢途径、关键酶及其基因的研究[1-3]。

莽草酸是合成许多生物碱、芳香氨基酸、吲哚衍生物与手性药物（如抗病毒药）的前体，莽草酸途径是芳香族氨基酸合成过程中的一段共同代谢途径，在微生物、真菌和植物中莽草酸途径肩负着连接糖代谢和次生代谢的重任，且动物的代谢网络中并不存在莽草酸途径。

莽草酸途径是指以磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸为初始底物，二者发生化合反应后再通过数步反应生成莽草酸，再由莽草酸生成芳香氨基酸和其他多种芳香族化合物的途径。葡萄糖在生物体内经糖酵解生成磷酸烯醇式丙酮酸（pep），经磷酸戊糖途径生成赤藓糖-4-磷酸(e4p)。pep和e4p在3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(简称 dahp 合成酶)催化下合成 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（dahp）。dahp 经过 3-脱氢奎尼酸合成酶（dhq 合酶）的催化反应生成 3-脱氢奎尼酸（dhq）,dhq 在 3-脱氢奎尼酸脱水酶（dhq 脱水酶）作用下生成 3-脱氢莽草酸（dhs）。dhs在莽草酸脱氢酶（sa 脱氢酶）作用下生成莽草酸（sa）。最终生成酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸 3 种芳香族氨基酸。

莽草酸脱氢酶作为莽草酸途径的关键酶之一，该酶将 3-脱氢莽草酸还原为莽草酸，同时受到莽草酸的反馈抑制。茶树中对莽草酸脱氢酶基因的研究较少，主要集中在对酶特性的研究^[4]，未见对于该基因克隆方面的研究。而国内对于大肠杆菌内的莽草酸途径研究较为详尽，包括莽草酸脱氢酶基因的克隆和表达^[5]、合成途径的调控^[6-8]。结核分支杆菌也有见相关莽草酸脱氢酶的克隆^[9]。

2. 研究的基本内容和问题

目标：对莽草酸脱氢酶基因进行克隆与表达

内容：1.提取茶叶中的总rna,并合成cdna.

3. 研究的方法与方案

研究方法及实验方案

1. 提取茶叶中的mrna，通过反转录pcr技术获得cdna；

2. 引物设计

4. 研究创新点

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一，具有许多生理保健作用。在包括中国在内的许多国家，茶树是重要的木本经济作物之一，它含有许多有价值的次生代谢产物。最近十多年来，茶树分子生物学研究是茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。分离和克隆重要的茶树功能基因，对揭示茶树优质、高产和抗逆的分子机理，对采用基因工程技术进行茶树遗传调控等都有重要意义。

5. 研究计划与进展

2014年1月-2月：相关资料收集与相关技术学习；

2014年2月-3月：茶树新叶的采收并进行rna的提取及cdna的合成；

2014年3月-4月：莽草酸脱氢酶的克隆与表达；