簇毛麦MAPK11-V转基因株系的筛选及抗旱性鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

我国小麦生产量居世界第一，消费需求量同样很大，但我国小麦生长的环境条件却不容乐观。随着全球气候变暖、极端天气频发，干旱和土壤盐渍化现已成为严重制约小麦高产、优质的重大因素。并且在自然生态系统中，一种非生物胁迫很少单独出现^[1]，干旱和土壤盐渍化现象往往并存，互为因果。因此，植物在长期应对逆境胁迫的进化过程中逐渐形成了一系列复杂又精密的信号转导机制^[2]，通过改变自身的生理状态来应对外界的环境变化，调整其生长和发育。其中，促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是植物体内高度保守且普遍存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，而整个MAPK级联途径是典型的通过蛋白质磷酸化及去磷酸化响应外界刺激，在植物体内的信号转导过程中扮演着重要角色。该途径由三种蛋白激酶成员组成，分别为促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK或MEK），促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK或MKK），促分裂原活化蛋白激酶（MAPK或MPK）^[3]。当植物在生长过程中受到外部不良环境影响时，植物就会通过细胞膜受体蛋白接受外界产生的刺激，磷酸化处于最上游的MAPKKK，使其激活，接着被激活的MAPKKK磷酸化MAPKK保守区域中S/T-X3-5-S/T序列，激活MAPKK，MAPKK再通过磷酸化MAPK的酪氨酸（Y）和苏氨酸（T）,从而激活MAPK。活化的MAPK再激活相应的转录因子，调控下游相关抗性基因的表达，从而提高植物对干旱等不良外界环境的抵抗力^[4]。簇毛麦（Haynaldia villosa）是小麦的野生近源物种，为一年生异花授粉植物，具有良好的抗旱、耐盐等抗逆特性，对小麦白粉病、锈病等多种病害都具有抗性^[5]，是小麦遗传改良的重要基因资源。关于簇毛麦MAPK基因的研究报道目前还很少，但测序技术的不断发展为以后簇毛麦MAPK家族的全基因组的挖掘、鉴定提供了良好的条件。近年来，许多研究结果表明植物可通过MAPK级联途径直接传递干旱信号，并激活下游相关抗旱基因的表达，从而提高植物的耐旱能力。在干旱胁迫下，拟南芥中的MEKK1被磷酸化激活，然后进一步激活MKK1/MKK2，MKK1和MKK2相互作用并激活下游的MPK4参与对干旱胁迫的响应^[6]。Archana Kumari等人^[7]的研究发现拟南芥通过将渗透胁迫信号整合进MAPK-SPCH核心转导途径中可以减少渗透胁迫下植物的生长量，以此来适应环境造成的植物渗透压不平衡。此外，MAPK信号途径还可通过激素调节参与抗旱性表达，拟南芥中的两种在保卫细胞中表达的MAPK（MPK9和MPK12）受ABA激活，参与ABA对气孔运动的调控过程，从而提高植物对干旱的适应能力^[8]。同样，许多研究发现植物体内的MAPK级联途径与植物耐盐性的提高密切相关。盐胁迫处理后，拟南芥mkk4缺失突变体植株的抗性低于对照，而超量表达的MKK4转基因植株的耐盐性高于对照，而且转基因植株中MPK3的活性也高于对照植株，看出MKK4激活了下游的MPK3，产生盐胁迫响应，使植株表现出一定的耐盐性^[9]。由此可见，植物中的MAPK信号级联途径在植物抗旱、耐盐生理中扮演着重要的角色。目前，MAPK基因在模式作物上的研究较为多样，但与簇毛麦MAPK基因相关的研究尚为有限，且少有研究涉及到MAPK基因与实际生产的大田作物之间产生的效果。本实验室前期已经筛选并克隆了数个受干旱及盐胁迫显著诱导表达的MAPK基因，并已转入小麦背景中，本课题将通过苗期模拟试验筛选出抗旱性及抗盐性提高的转簇毛麦MAPK基因的小麦株系，评价簇毛麦MAPK基因在小麦应对干旱及盐胁迫中的抗性功能，旨在为后期研究通过基因工程技术提高小麦对干旱及土壤盐渍化等不良环境的抵抗能力打下基础，以进一步提高小麦总产及单产，提升小麦品质，满足人们日益提高的消费需求。参考文献：[1] Krasensky J, Jonak C. Drought, salt, and temperature stress-induced metabolic rearrangements and regulatory networks[J]. Journal of Experimental Botany, 2012,63(4):1593-1608.DOI:10.1093.[2] 王洁. 植物MAPK级联途径基因家族的进化分析及番茄SlMPK13的功能鉴定[D]. 浙江大学, 2015.[3] 朱熙. 马铃薯MAPK基因鉴定及抗旱相关MAPK功能基因筛选[D]. 甘肃农业大学, 2016.[4] Ulm R. Distinct regulation of salinity and genotoxic stress responses by Arabidopsis MAP kinase phosphatase 1[J]. The EMBO Journal, 2002,21(23):6483-6493.DOI:10.1093.[5] 荣曼. 携带抗白粉病基因Pm21的簇毛麦小片段易位系的改良[D]. 南京农业大学, 2013.[6] 张兴坦. 烟草MAPK基因的功能研究[D]. 重庆大学, 2015.[7] Kumari A, Jewaria P K, Bergmann D C, et al. Arabidopsis Reduces Growth Under Osmotic Stress by Decreasing SPEECHLESS Protein[J]. Plant and Cell Physiology,2014,55(12):2037-2046.DOI:10.1093.[8] Xing Y, Jia W, Zhang J. AtMKK1 mediates ABA‐induced CAT1 expression and H2O2 production via AtMPK6‐coupled signaling in Arabidopsis[J]. The Plant Journal, 2008,54(3):440-451.DOI:10.1111.[9] Kim J, Kim S, Woo D, et al. Arabidopsis MKK4 mediates osmotic-stress response via its regulation of MPK3 activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011,412(1):150-154.DOI:10.1016.

2. 研究的基本内容和问题

本实验室前期筛选并克隆数个受干旱及盐胁迫显著诱导表达的簇毛麦MAPK基因并转入到小麦背景中获得转基因株系，本课题将通过苗期模拟干旱胁迫及盐胁迫试验筛选出抗旱性及抗盐性提高的转簇毛麦MAPK基因的小麦株系，结合转基因株系的PCR分子鉴定，明确抗性提高的转基因阳性植株并评价簇毛麦MAPK基因在小麦应对干旱及盐胁迫中的抗性功能。

本课题拟解决的关键问题在于对转基因株系抗旱及抗盐性筛选的准确性，即如何确定抗旱及抗盐性筛选的指标，建立正确的评价标准及体系。既要保证转基因株系筛选的全面性，无遗漏，也要提高精确性，避免造成过大的工作量。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1. PCR分子鉴定：转基因分子标记鉴定

2. 模拟试验：模拟干旱胁迫、盐胁迫试验

3. 数据统计及可视化

4. 条件筛选

技术路线：

实验方案：

1.转基因材料T0代进行分子鉴定

2.转基因材料T1代初步调查田间农艺性状

3.转基因材料T2代植株进行室内PEG6000模拟干旱胁迫抗性鉴定

a)取T1代单株收获的种子10-12粒，用10%过氧化氢溶液浸泡10分钟，清水冲洗

b)将消毒的种子置于双层滤纸上，保持25℃使其露白

c)将露白的种子摆放在蛭石上，生长至三叶一心时，用20%PEG6000溶液处理9天，统计第一、第二 、第三叶片的萎蔫程度

d)清水冲洗干净后，复水恢复8天，统计第四叶、第五叶叶片长度，地上部/地下部的干鲜重

e)将筛选出的株系重新发苗移栽至白马网室

f)三叶一心时进行转基因分子标记鉴定

4.转基因材料T2代植株进行室内模拟盐胁迫抗性鉴定

a)取T1代单株收获的种子10-12粒，用10%过氧化氢溶液浸泡10分钟，清水冲洗

b)将消毒的种子置于双层滤纸上，保持25℃使其露白

c)将露白的种子摆放在蛭石上，生长至三叶一心时，用200mM的NaCl溶液处理20天，统计枯叶数占总叶数的百分比

d)清水冲洗干净后，复水恢复7天后，统计新叶长；复水恢复10天后，统计枯叶数占总叶数的百分比以及地上部/地下部的干鲜重

e)将筛选出的株系重新发苗移栽至白马网室

f)三叶一心时进行转基因分子标记鉴定

可行性分析：

1.本实验室前期已筛选并克隆出数个受干旱及盐胁迫显著诱导表达的MAPK基因，并且已将MAPK基因转入小麦背景中，获得了簇毛麦MAPK基因的转基因材料；

2.所在课题组依托的实验室属于作物遗传与种质创新国家重点实验室，具有良好实验条件，其中包括开展本研究所需要的超低温冰箱、离心机、PCR仪、电泳槽、制冰机、凝胶成像系统等相关器材，实验设施齐全，能够满足本课题的试验需求。

3.本课题难度适中，既能够巩固理论知识并应用于实践，同时也可以锻炼实验操作，增强实验技能。再加上导师的悉心指导，课题完成度较高。

4. 研究创新点

簇毛麦作为小麦的野生近缘物种，对生物胁迫及非生物胁迫都具有良好的抗性，是小麦遗传改良的重要基因资源。MAPK基因的相关研究在许多植物中都有开展，如番茄、烟草、马铃薯、拟南芥等等，但簇毛麦中MAPK基因的研究报道较少。本课题是围绕簇毛麦MAPK基因功能研究开展的，挖掘簇毛麦中与干旱及盐胁迫相关的基因，并转入到小麦背景中，研究其在小麦应对干旱及土壤盐渍化等不良环境下的功能发挥，以提高小麦抗逆性，增加小麦产量，满足市场需求。

5. 研究计划与进展

研究计划：

1)2018年7月至2018年12月：t2代转基因材料的苗期筛选鉴定；

2)2018年1月至2018年3月：转基因株系的pcr分子标记鉴定；