棉花抗旱基因的挖掘及其抗旱功能鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

植物在其生长周期过程中经常会遇到一些逆境胁迫，包括生物逆境胁迫和非生物逆境胁迫(mahajan et al.,2005)。生物逆境主要包括病原菌侵染，虫害及机械损伤,非生物逆境胁迫主要包括干旱、高温、低温、重金属胁迫等。由于植物是固着生物，当遭遇以上逆境的胁迫时，会对植物的生长发育造成不同程度的影响(杨果果 etal.,2016)。棉花生产是纺织工业及国防建设的重要物质基础，也是中国农业重要组成部分，对中国国民经济的发展有着重要的影响，在世界棉花贸易市场上也起着举足轻重的作用。随着全球气候变暖和人类活动加剧，干旱有明显加重的趋势（秦大河，2009）。并且，每年由于旱灾引起的棉花年减产量达总量的30%以上（张玲等，2008）干旱已经成为限制棉花生产的重要因素，因此，有效挖掘抗旱基因,并采用基因工程的方法培育抗旱新品种具有十分重要的意义。

钙受体蛋白是一类广泛存在于植物界的含有ca2 结合的 ef-hand 结构域的蛋白，能调控植物的多种生物学过程（day i s et al.,2002）。在植物中，钙受体蛋白分为以下几类:钙调素蛋白(cam)、类钙调素蛋白(cmls)、钙依赖的蛋白磷酸酶(cdpks)、钙调磷酸酶b-like蛋白(cbls)和钙调磷酸酶b-like 相互作用激酶(cipks)(hashimoto k et al.,2011; Ｒeddy a s,2001)。cmls 是一类类钙调素(cams)钙受体蛋白，与钙调素蛋白氨基酸的相似性不少于16%，每个蛋白有 2 ～ 6 个保守的 ef-hand 结构域，每个ef-hand 结构域为螺旋－环－螺旋结构且只能结合一个ca2 （kretsingerＲ h et al.,1973）。

在水稻与拟南芥中，分别已鉴定出 32 个（boonburapong b et al.,2007）和50 个(mccormack e et al.,2003)cmls 基因，它们广泛参与细胞的生物学过程，包括生物胁迫与非生物胁迫。如在拟南芥中，cml24 积极响应 aba 与盐的胁迫，其拟南芥的超表达植株提高了对 cocl2 、znso4 和 mgcl2 的耐受性 (delkn a et al.,2005)。cml42 在细胞毛状体的形成过程中起着重要的作用(dobney s et al.,2009)。cml9 不仅可以通过调节aba 途径增强对盐和干旱的耐受性，而且影响拟南芥根的发育(magnan f et al.,2008)。

rna介导的基因沉默是近年来在生物体中发现的一种基于核酸水平高度保守的特异性降解机制。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,vigs)是指携带植物功能基因cdna的病毒在侵染植物体后,可诱导植物发生基因沉默而出现表型突变, 进而可以研究该目的基因功能。至今已经建立了以rna病毒、dna病毒、卫星病毒和dna卫星分子为载体的vigs体系,这些病毒载体能在多种寄主植物(包括拟南芥、番茄和大麦)上有效抑制功能基因的表达。vigs已开始应用于n基因和pto基因介导的抗性信号途径中关键基因的功能研究、抗病毒相关的寄主因子研究以及植物代谢和发育调控研究。在当前植物基因组或est序列大量测定的情况下,vigs为植物基因功能鉴定提供了有效的技术平台。

2. 研究的基本内容和问题

随着测序技术的不断发展及成熟，转录组分析（mRNA-seq）作为一种简单，操作性强，结果相对可靠的测序技术，为在整个转录水平阐述棉花耐旱机制提供了可能。本研究在TM-1旱诱导转录组中发现，与对照相比，CML基因在旱处理后6，12，24，48，72h5个时期表达量都上升，2OG oxygenase在旱处理后12h时期表达量都上升。推测二者与棉花旱胁迫相关。

病毒诱导的基因沉默是普遍存在于植物中的一种遗传免疫机制，属于转录后基因沉默，该技术可以从反向遗传学角度迅速鉴定基因功能。与传统的转基因方法相比，VIGS 具有操作简单、周期短、成本低等优点。为快速鉴定基因功能提供了一种有效的方法(Annette and Matthias，2009)。本研究通过构建病毒载体，将目的基因沉默，通过对沉默植株的耐盐性评价，从反向遗传学角度分析CML和2OGoxygenase功能。希望能为这两个基因的后续功能研究提供抗逆方面的证据。

3. 研究的方法与方案

研究方法

1、实时荧光定量pcr:进行诱导表达分析

2、vigs技术：构建trv载体侵染棉花（tm-1），并进行旱处理（15%peg处理），观察表型，并测相关生理指标

4. 研究创新点

尽管CMLs基因家族在多种植物已经有所报道，但是CMLs基因家族包含的基因数目较多，而且缺少具体的功能研究。本研究可以在前人的基础上进一步探究具体基因在具体性状上的作用，为之后的CMLs基因功能研究提供一定基础。

5. 研究计划与进展

1. 基因的克隆、测序2018.10.01-2018.11.03

2. 定量引物设计及旱诱导验证2018.11.10-2018.12.10

3. vigs种苗及沉默效率检测2019.02.20-2019.03.10