NCED家族基因调控棉花抗旱性的功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题的意义：

9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,nced)是脱落酸(aba)合成途径关键限速酶蛋白，aba在植物应对干旱胁迫过程中起到重要作用。棉花是重要的经济作物，棉纤维是世界上最重要的天然纺织原料。然而，对nced基因在棉花发育过程中的作用仍然报道较少。本项目计划对筛选到的nced基因进行抗旱功能的初步鉴定，为进一步的功能分析和验证做基础。

国内外研究进展：

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

对nced基因家族进行初步分析，并筛选出其中的关键基因进行功能验证。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

1、基因克隆以雷蒙德氏棉（g.raimondii）中预测到的基因为参考序列设计特异引物，以棉花材料tm-1的cdna为模板，利用pcr扩增的方法，扩增出目的片段。pcr扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳分离，采用axygen胶回收试剂盒回收目的片段。接着使用clonexpress快速克隆技术将回收到的片段直接连接到目的载体上。通过大肠杆菌转化的方法，将载体转化进入感受态细胞。然后涂板，倒置于37℃培养12~16h。每板挑取6-12个单克隆，接菌于含有合适抗生素的lb液体培养基37℃培养4-6h。取2μl菌液作为pcr模板，使用m13通用引物进行检测，并用特异引物进一步检测。阳性克隆的菌液送交生物技术公司进行测序。2、荧光定量pcr分析病原菌诱导下的表达特征取干旱或者盐处理后不同时期的棉花植株叶片提取rna，通过逆转录反应得到cdna，以cdna为模板，在荧光定量pcr仪上分析，仪器根据我们人为设定荧光域值计算出的每个样品孔的ct值，然后根据目的基因和内参基因标准品的拷贝数与其相对应的ct值来分别绘制目的基因和内参基因his3的标准曲线，并考察标准曲线的线性关系和斜率。每个样品均3个重复。对于每一个待测样品，根据其ct值我们可以分别计算出其相对表达量。3、病毒介导基因沉默用到的载体分别是ptrv1和ptrv2，用棉花白化基因（ghcla1）作为表型对照。通过同源重组方法将扩增片段插入ptrv2载体上获取重组质粒，经测序后得到正确的重组载体。将重组载体转入农杆菌gv3101菌株中，挑取单克隆进行pcr扩增，进一步检测插入片段的正确性，将成功转入目的基因的菌液置于-70℃保存备用。待棉花幼苗长至两片子叶完全展开后进行农杆菌接种实验。采用叶片针筒浸润法,先用注射器针头轻轻刺破叶背面造成微伤口,用去针头的注射器从背面伤口处注入菌液，以整个叶面出现水泽状为佳，说明菌液已成功注射至子叶。分别以trv1/trv2：cla1(阳性对照)、trv1/trv2(阴性对照)作为沉默处理的阳性对照和阴性对照。将注射后的棉花幼苗置于23℃，16h/8h光/暗周期下培养，约两周后目的基因沉默。每种基因接种30棵棉花单株。

4. 研究创新点

尽管NCED基因家族在多种植物已经有所报道，但是NCED基因家族包含的基因数目较多，而且缺少具体的功能研究。本研究可以在前人的基础上进一步探究具体基因在具体性状上的作用，为之后的NCED基因功能研究提供一定基础。

5. 研究计划与进展

2019.02.16-2019.03.25完成实验、提交草稿

2019.03.25-2019.0423完成论文定稿