1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
簇毛麦因具有多种优异性状基因，常被作为小麦品种改良的重要基因资源之一。相比wrky在其它植物中的系统研究，簇毛麦尚未有关于wrky基因的研究报道。本课题的研究主要通过分子生物学技术，挖掘簇毛麦wrky基因并对wrky基因沉默植株进行抗病分析，以此深入了解簇毛麦抗白粉病的信号通路。这将对理解簇毛麦wrky转录因子的生物学功能及其与白粉菌相互作用机制方面具有重大意义。
自1994年, ishiguro和nakamura[1]首次从甘薯 (ipomoea batatas) 中克隆出第一个wrky蛋白spf1, 研究人员对于植物wrky转录因子家族开展了大量研究。wrky转录因子通过其n端的高度保守的氨基酸序列 (wrkygqk)对靶基因启动子区域的w-box[(t)tgacc(at)]进行特异识别，并调控其转录表达[2]。因此，wrky家族对于作物生长过程中的代谢调控、发育衰老调控、植物防御应答、形态学建成等都有着重要的作用[3]。
wrky转录因子是植物中广泛存在的、最大的转录调控因子家族之一，是植物生命活动中起调控作用的重要因子，参与了各种信号转导过程、生物与非生物胁迫的响应[4]。目前，wrky转录因子在生物胁迫方面的作用研究得最为广泛。例如，拟南芥中的wrky33可与调控脱落酸aba生成的基因nced3和nced5结合，抑制脱落酸的生成，从而完成抑制真菌灰葡萄孢菌感染[5]；wrky55参与大麦黄花叶病的病毒感染过程[6]；oswrky53是一个稻瘟菌的正调控因子，它的过量表达和磷酸化突变体能使其对稻瘟菌的抗性增强，它一方面受到丝裂原活化蛋白激酶基因os mpk3/os mpk6的正向调控，另一方面又可以反过来抑制了它们的活性，从而减少食草动物侵害植物诱导的防卫反应，增加了二化螟的侵害[7]。ren等[8]利用rnai技术研究烟草转录因子wrky4的作用时发现，ntwrky4与叶片形态的形成和抗病毒过程有着密切联系。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：利用生物信息学和分子生物学的方法，通过对簇毛麦wrky基因挖掘和表达分析，了解簇毛麦抗白粉病的信号通路，揭示wrky转录因子在簇毛麦中的抗病分子机制。
研究的内容：研究对象为簇毛麦，利用大麦wrky基因与实验室自测三代簇毛麦转录本进行比对，筛选出15个同源性最高的转录本数据。本研究用病毒介导的基因沉默方法沉默掉wrky保守结构域，通过对基因沉默前后白粉菌侵染情况进行观察统计，最终确定目的基因在簇毛麦抗白粉病过程中的功能，了解簇毛麦抗白粉病的信号通路。
研究拟解决的关键问题：簇毛麦因具有多种优异性状基因，常被作为小麦品种改良的重要基因资源之一。相比wrky在其它植物中的系统研究，簇毛麦尚未有关于wrky的研究报道。本研究将为进一步研究簇毛麦wrky转录因子的生物学功能及其与白粉菌相互作用机制奠定基础。
3. 研究的方法与方案
研究方法如下：前期利用生物信息技术，将大麦wrky基因比对三代簇毛麦的转录本得到wrky基因序列,以此筛选出相关wrky基因。中、后期主要采用病毒诱导基因沉默(vigs-induced gene silencing, vigs)技术，利用大麦条纹花叶病毒（bsmv）作为载体，侵染簇毛麦苗，观察接种后的表型。具体方法如下：第一步，构建携带目标基因片段的重组质粒、筛选有插入子的阳性克隆；第二步，分别抽提bsmv病毒载体α、β、γ-pds、γ-gfp和携带有目标基因外源插入片段的重组γ质粒；第三步：载体的线性化，确保酶切完全；第四步：对酶切产物进行纯化回收；第五步：在体外进行转录反应；第六步：等体积混合α链转录物、β链转录物与γ链转录物；第七步：给植株接种转录产物，接种后大约一周，即可从第三叶叶片基部观察到病毒侵染的表型；第七步：基因沉默效率检测；第八步：观察统计基因沉默后对簇毛麦抗白粉病表型的影响。
技术路线如下：筛选wrky目的基因→vigs技术→接种转录产物至植株→检测基因沉默效率→观察统计簇毛麦抗白粉病表型
可行性分析：第一，本课题是根据前人在植物中的wrky转录因子的研究的基础上进行的横向拓展研究，将实验对象从热门的拟南芥等模式作物转向簇毛麦。第二，本实验的工作量适中，操作难度适中，适合本科学生的研究水平。第三，本实验采用病毒诱导基因沉默 (vigs-induced gene silencing, vigs) 技术，该技术是一种引起内源mrna特异性降解、引起基因转录沉默的技术。vigs试验周期短, 操作简便, 并且无需转化，保证了实验进度。第四，时间分配合理，本课题的研究时间较为充裕，在实验前已规划好各环节的时间节点以及预计成果。第五，实验者具备较全面的专业知识，具有规范的实验操作能力，并拥有类似的研究经验。
4. 研究创新点
（1）WRKY转录因子的在植物中的研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中。本项目可以丰富WRKY基因在簇毛麦中的研究，了解簇毛麦抗白粉病的信号通路。
（2）簇毛麦 (Haynaldia villosaL.,2n=14，VV)为一年生异花授粉植物，是小麦的野生近缘物种，对白粉病、锈病及梭条花叶病毒病等多种病害都具有抗性。簇毛麦因具有多种优异性状基因，常被作为小麦品种改良的重要基因资源之一，因此本研究可对小麦育种提供一定得参考。
5. 研究计划与进展
2018.7.14-2018.7.20 网上查阅wrky转录因子在植物中的研究进展等相关文献。
2018.7.21-2018.7.30 完成文献综述的写作。
2018.7.30-2018.8.30 学习并完成引物设计，设计上、下游特异性沉默引物 wrky-vigs-f和wrky-vigs-r。
课题毕业论文、文献综述、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
