转MAG1166基因的抗病性鉴定与分子检测开题报告

 2023-02-11 13:20:32

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

小麦赤霉病是世界温暖潮湿和半潮湿地区广泛发生的一种小麦毁灭性病害,在中国长江中下游和华南冬麦区及东北春麦区东部尤为严重,近年在黄河流域及其它地区也时有发生。中国小麦赤霉病的发生面积已超过7106hm2,约占全国小麦总面积的1/4[1]。小麦感染赤霉病后,不仅严重减产,而且品质恶化,种用价值降低。

目前,防治小麦赤霉病手段有多种,但大都存在明显缺陷。喷洒杀菌剂[2]是最常用的化学防治手段,然而病原菌极易发生变异,抗药性增长较为迅速,往往一种新药或新剂型投入使用后几年就面临药效降低的烕胁;另一方面,农药的大量使用会显著增加食品安全风险,这些因素都严重制约杀菌剂的作用。由于地理位置、气候因素和农业生产者自身等方面原因,栽培措施也不能充分发挥作用。颇受研究者青睐的生物防治存在成本高、时效性差,对控制突然爆发的赤霉病作用不大。因此,应用现代分子生物学技术并结合传统遗传育种方法培育抗病品种,是控制小麦赤霉病的最佳解决方案。

KangZ[3][4][5]等和CaremV[6]等分别利用免疫电镜和激光共聚焦显微成像技术观察赤霉病菌侵染小麦穗部的过程,发现花药存在可以促进赤霉菌菌丝生长。需要指出的是,发病穗部产生的菌丝体和分生孢子不足以引发其它健康穗子发病,病害发病程度与田间初侵染量密切相关[7]。

研究者尝试利用转基因或分子标记辅助选择的方法增强赤霉病的抗性,Shin[8]将来自于大麦的UDP-葡萄糖基转移酶基因HvUGT13248转入拟南芥,稳定表达抗原标记的HvUGT13248的转基因植株表现苗期对于DON的耐受性增强,且与野生型相比有更高的将DON转化为D3G的转化效率,与过表达DOGT1而导致油菜素内酯积累而矮化的拟南芥相比,表达大麦HvUGT13248不会导致表型的剧烈变化,对表达HvUGT13248的酵母进行观察,未检测到油菜素内酯前体的合成,与之相同的是Li[9]等将大麦UDP-葡萄糖基转移酶(HvUGT13248)转入小麦中并评估转基因小麦的赤霉病抗性、DON积累量以及将DON代谢成为毒性较低的DON-3-O-葡萄糖苷的能力,得到了相似的结果,转基因小麦抗扩展抗性明显高于非转基因对照,在小麦中表达HvUGT13248可以迅速有效地将DON转换成为D3G,发苗试验证明转基因植株对DON抑制根的生长有着更强的耐受性,这些结果证明可以将酶解DON作为一种控制赤霉病的手段。Cheng等[10]利用基因枪轰击法将来自于鸡的禾谷镰刀菌特异的重组抗体融合蛋白CWP2以及用于生物防治的真菌木霉菌中的几丁质酶基因Ech42导入优质小麦品种郑麦9023,不但成功提高了转基因小麦的赤霉病抗性,而且还使外源基因特异表达于外稃/内稃中,最终通过回交转育将外源基因转入感赤霉病品种Huamai13中并显著提高其赤霉病抗性。

MAG1166属于羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸/莽草酸羟基肉桂酰转移酶家族,是本实验室前期研究中得到的一个与赤霉病相关的基因,我们以扬麦158为背景转入MAG1166基因,并筛选得到MAG1166过表达的植株进行小麦赤霉病抗性鉴定,以验证MAG1166与小麦赤霉病抗性是否相关。

参考文献

[1]姚金保.小麦赤霉病的抗性遗传分析[J].江苏省农业科学院农业生物技术研究所,2011,31(2):370-375

[2]许峰.望水白抗赤霉病主效QTL的遗传和效应研究[J].南京农业大学博士论文

[3]KangZBuchenauerH.ImmunocytochemicallocaalizationofFusariumtoxinsininfectedwheat[J].PhysiolMolPlant,1999,55275-288

[4]KangZBuchenauerH.Immunocytochemicallocaalizationofβ-1,3-glucanasechitinaseinFusariumculmum-infectedwheatspikes.PhysiolMolPlant,2002,60141-153

[5]KangZBuchenauerH.StudiesontheinfectedprocessofFusariumlocalizationoftrichothecenetoxinsininfectedtissue.EurJPlantPathol,2002,180653-660

[6]CaremV,RechiaFR,AierakoqskiMR.XyloglucanoctasacideXXLGOLderivedtheseedsofhymenaeacourbarialactsasasignalingmolecule.PlantPhysculmuminwheatspikesDegradationofhostcellwallcomponentsiol,1998,1161013-1021

[7]陈利峰.农业植物病理学.中国农业出版社,2002

[8]Shin,S.,etal.TransgenicArabidopsisthalianaexpressingabarleyUDP-glucosyltransferaseexhibitresistancetothemycotoxindeoxynivalenol.JournalofExperimentalBotany,2012,63(13)4731-4740.

[9]Li,X.,etal.TransgenicWheatExpressingaBarleyUDP-GlucosyltransferaseDetoxifiesDeoxynivalenolProvidesHighLevelsofResistancetoFusariumgraminearum.MolPlantMicrobeInteract,2015,28(11)1237-1246.

[10]Cheng,W.,etal.Tissue-specificpathogen-inducibleexpressionofafusionproteincontainingaFusarium-specificantibodyafungalchitinaseprotectswheatagainstFusariumpathogensmycotoxins.PlantBiotechnologyJournal,2015,13(5)664-674.

2. 研究的基本内容和问题

实验室前期研究得到MAG1166基因,但并不确定该基因具体功能,本课题通过对转基因植株的筛选鉴定及接种赤霉病小种混合悬浮液后的表型鉴定来确定该基因是否与小麦赤霉病抗性相关。

3. 研究的方法与方案

研究方法:对实验室前期得到的mag1166转基因植株进行鉴定,筛选得到mag1166过表达植株,通过单花滴注和喷雾赤霉菌悬浮液的方法,鉴定mag1166基因对赤霉病的抗性。

技术路线:设计mag1166的特异引物,扩增基因序列,鉴定阳性植株,进行赤霉菌侵染,鉴定植株表型,确定mag1166与小麦赤霉病抗性相关性

实验方案:通过pcr技术将前期得到的mag1166转基因植株进行筛选,得到含有mag1166的阳性植株,并制备赤霉菌小种混合悬浮液,在开花期对阳性植株和对照扬麦158进行单花滴注和喷雾赤霉菌处理,14至20天后进行鉴定,对于单花滴注处理的植株,统计其病小穗数和病轴长;对于喷雾处理的植株则统计其病小穗数进行数据分析。

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4. 研究创新点

MAG1166是一个实验室前期工作中得到的有关于小麦赤霉病的未知功能的基因,本课题的创新之处是对新基因抗病功能的进行了分析。

5. 研究计划与进展

2015.10-2015.11:学习基本实验技术、了解掌握本课题原理;播种mag1166转基因植株

2015.12-2016.1:挂牌取样

2016.2-2016.3:dna提取及鉴定阳性植株、制备赤霉菌小种混合悬浮液

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