植物病原菌终极腐霉的LAMP检测技术体系开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

腐霉菌隶属腐霉属（pythium）腐霉科（pythiaceae）霜霉目（perenosporales）卵菌纲（oomycetes）藻物界（chromista）^[1]。腐霉菌是多种植物病害的病原菌，能引起苗腐、根腐、根茎腐及果和种子腐烂甚至植物猝倒等，对农业生产损失严重^[2]。

目前，全世界总计报道过的腐霉菌有200多种，我国共报道过腐霉菌有62种，其中能侵染植物引起病害的有40种^[3-4]。腐霉（pythium）的寄主范围非常广泛，能侵染多种豆科、葫芦科、茄科、禾本科等植物造成不同程度的腐烂症状，已成为许多农作物苗期病害重要致病菌之一。番茄茎基腐病的病原为终极腐霉（pythium ultimum），是番茄生长过程中的主要腐霉病害，该病原菌广泛分布于土壤中。在番茄的整个生育期均有发生，其在番茄苗期发生尤为严重。随着大棚蔬菜种植技术的推广普及，人为改善大棚的内部环境条件，使大棚内部终年呈现高温高湿环境，也为各种病原微生物的生长繁殖条件提供了良好，从而导致各种病害的频繁发生，这些条件更是利于番茄茎基腐病的发生，使番茄严重减产。

由于不同的腐霉菌引起的病害症状极为相似，传统的检测方法是依据腐霉的形态学进行分离鉴定，但是腐霉菌形态多变，性器官发育不稳定，其鉴定还比较困难。因此建立一种快速检测终极腐霉（pythium ultimum）的方法对植物疫病的控制非常重要。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, lamp）是日本荣研株式会社发明的一种核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、不需要昂贵复杂的检测仪器，这就很大程度上降低了基层部门的检测成本，非常适合基层和出入境口岸等大批量植物病原菌的快速检测^[6]。目前lamp检测技术已广泛应用于对病毒、细菌、真菌等病原菌的检测^[7]，但还没有应用到终极腐霉的检测中，因此本研究拟建立终极腐霉的lamp检测技术。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标:建立植物病原菌终极腐霉的lamp检测方法的体系。

研究内容：1.终极腐霉靶标基因的筛选和lamp引物的设计；

2.终极腐霉的lamp技术体系建立；

3. 研究的方法与方案

研究方法：

根据已公布的终极腐霉和其它植物腐霉的全基因组序列，基于比较基因组学的方法，鉴定出一些候选的终极腐霉的靶标基因，使用在线软件primerexplore v4在靶标基因内部设计lamp引物，引物包括：f3/b3外引物、fip/bip内引物和lf/lb环引物。提取终极腐霉菌的dna，取2 μl dna溶液作为反应模板，加入23 μl lamp试剂盒中的检测溶液进行lamp，lamp反应程序为：64℃反应扩增60 min，然后观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为天蓝色，表示待检物中存在目的终极腐霉菌，如果颜色没有变化仍是紫色，表示待检物中不存在终极腐霉菌。

技术路线：

4. 研究创新点

1.本文是首次报道应用环介导等温核酸扩增技术检测终极腐霉菌，该方法的建立为

终极腐霉菌的检疫和其所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。

2.本文分析了终极腐霉和其他腐霉菌在序列上的差异，设计了特异性的lamp引物，在此基础上建立了检测终极腐霉菌的lamp体系。终极腐霉菌的整个lamp检测过程仅需60 min，即可通过肉眼直接目测实验结果。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2015.10月：生物信息学鉴定终极腐霉特异的靶标基因，并设计lamp引物；

2015.11-12月：建立终极腐霉lamp反应体系；