辣椒疫霉菌CRN效应因子的克隆及其细胞死亡诱导活性分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

卵菌(如疫霉菌、霜霉病菌)可引起毁灭性的植物病害，在全世界范围内造成巨大的经济损失。卵菌在形态学上类似于丝状真菌，但在进化上与藻类的亲缘关系较近，隶属于茸鞭生物界(erwin,1996;kamoun,2003)。而近几年数个卵菌全基因组测序的完成,以及卵菌遗传转化技术的建立,使得卵菌逐渐成为植物-病原物互作的研究热点(schomacketal.,2009)。kamoun认为卵菌效应分子就是一种病原菌分泌的蛋白分子,可以操纵寄主细胞的一些结构和功能,利于病原菌的侵染或引起寄主的防卫反应。这些效应分子可以是激发子,也可能是毒素,对于病害的产生并非一定就是有害或有利,就概念上来说,效应分子是个中性词。近年来对卵菌效应分子的进化、转运和功能的研究增进了对植物病理学科一些概念的理解(birchetal.,2006;kamoun,2006.2007;morganandkamoun,2007;birchetal.,2008;birchetal.,2009;tyler.2009)。

效应分子在病原物和寄主的互作中起到了至关重要的作用。效应分子可以用来鉴定相应的r蛋白,然后可进一步研究效应分子不同的识别区域(vleeshouwersetal..2006;ellisetal?,2009;ohetal.,2009)。对于效应分子的研究可以加速r基因的克隆从而避免做一些的无用功。在刚开始研究这类效应分子时,这类基因是从致病疫霉的基因组序列中挖掘出来的,采用了在野生型的马铃薯种质中高通量表达分析來揭示无毒功能活性,并且加速了相对应的r基因的克隆(vleeshouwersetal..2008)。有了与抗病基因的互作的效应分子,可协助农业上抗病基因的应用。通过对病原菌群体效应分子变异分布(与活性相联系)的评价,可用于监测病原菌群体中潜在发生和出现克服抗病基因的小种(schomacketal..2009)。

疫霉菌分泌大量的效应物蛋白进入植物细胞，干扰寄主植物细胞的正常生理和功能，促进病原菌的侵染和定殖。全基因组测序发现，疫霉菌可以编码数百个胞内效应因子。其中有一类胞内效应因子因其在植物所中表达可以引起叶片皱缩和细胞死亡，被成为cinklingandnecrosis-inducingprotein(crn）效应因子。然而，crn效应因子的细胞死亡诱导活性对其发挥毒性功能是不是必须的尚不明确。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：辣椒疫霉菌crn效应因子的克隆及其细胞死亡诱导活性分析。

研究内容：从辣椒疫霉菌的基因组中克隆crn效应因子，并将其连接到马铃薯x病毒载体(potatovirusx,pvx)上获得阳性克隆。将构建好的质粒转化到农杆菌中，并将其注射烟草叶中，观察分析细胞死亡诱导活性情况。

拟解决关键问题：

3. 研究的方法与方案

研究方法：首先辣椒疫霉菌基因组提取，再利用pcr技术扩目的片段并切胶回收，同时pvx载体的酶切并切胶回收，目的片段的酶切并pcrcleanup ，再连接目的片段并转化到大肠杆菌，然后菌落pcr并送测序、提取质粒，接下来转化根癌农杆菌，最后注射本氏烟叶片, 观察表型。

实验方案：

1.烟草生长与种植本氏烟(nicotianabenthamiana)在温室(22-25c,高光强度)中生长4到6周供试验所用(douetal..2008b)。

4. 研究创新点

本研究有一下特色和创新之处：

1.从实验材料方面：辣椒疫霉菌可以侵染本氏烟和拟南芥，为后续进一步研究crn效应因子的功能和作用机制提供了便利；

2.本氏烟结合了实验室前期的转录组数据，选取的效应因子均为侵染阶段上调表达的基因，克服以往没有转录组数据，仅从基因组数据出发开展效应因子研究的盲目性。

5. 研究计划与进展

2013年8月转录组数据的分析及待克隆crn效应因子的选取；

2013年9月引物设计及crn效应因子的克隆；

2013年10月转化根癌农杆菌及在本氏烟叶片上测试克隆crn效应因子的细胞死亡诱导活性；