灰霉病菌甲硫氨酸合成途径的基因克隆开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

由灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)引起的草莓灰霉病是世界各国草莓生产上的主要病害，在中国各草莓产区无论保护地栽培还是露地栽培均有发生，尤其是保护地草莓生产发生普遍、危害最为严重。据调查：病害造成的烂果减产100%以上，重者可达50%以上，严重影响草莓的产量和品质。灰霉病菌具有繁殖快,遗传变异大和适合度高的特点,连续使用同一药剂易产生抗药性。1971年世界上首次报道了在荷兰温窒中仙客来上发现了灰霉病菌抗多菌灵菌株(bellen和seholten,1971);1987年周明国等在南京、上海等地也发现了灰霉病菌抗多菌灵菌株。目前,灰葡萄孢已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、n-苯氨基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类杀菌剂产生了不同程度的抗性。

嘧霉胺低毒，水溶解性为0.121g/l。兼具保护和治疗作用,叶间疏导性不强。在根部施用嘧霉胺时表现出较强的内吸性能。对二甲酞亚胺类、苯并咪哩类以及乙霉威已经产生抗性的菌株,也有很好的防治效果。但近些年随着嘧霉胺的广泛使用，在田间已经产生大量的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗性菌株。已有的研究表明嘧霉胺与灰霉病菌中的甲硫氨酸的合成相关，所以本文分别选取对嘧霉胺敏感和抗性菌株，对甲硫氨酸合成途径中的重要基因进行克隆，然后比对碱基序列，为研究嘧霉胺对草莓灰霉病菌的毒理提供理论依据。

参考文献：

2. 研究的基本内容和问题

本研究的目标是对嘧霉胺对草莓灰霉病菌的毒理作用进行初步探索研究。

甲硫氨酸是灰霉病菌蛋白质的重要组成部分，在灰霉菌体内有17个基因参与调控甲硫氨酸的生物合成途径。目前，灰霉菌对作用于其甲硫氨酸合成途径的药物嘧霉胺产生了不同程度的抗药性，但抗性机理和嘧霉胺的作用机理还不是十分明确。

该课题通过应用筛选计量法筛选出草莓灰霉病菌对嘧霉胺敏感和高抗菌株，然后在数据库中查找病原菌中甲硫氨酸合成途径主要的基因进行克隆，比对敏感和抗性菌株之间的碱基序列，找出突变位点，进而从分子水平推测嘧霉胺的毒理作用。

3. 研究的方法与方案

研究方法：应用常规pcr方法克隆目的基因，根据测序结果用bioedit进行序列比对。

技术路线如下：

1.用筛选计量的方法选出对嘧霉胺敏感和抗性菌株。

4. 研究创新点

目前，嘧霉胺对灰霉病菌的作用靶标尚不清楚，本文希望通过克隆基因，找到差异基因，然后利用基因敲除等一些分子生物学方法，找到嘧霉胺的作用靶标，明确嘧霉胺的毒理机制，对于开发新型杀菌剂具有重要作用。

5. 研究计划与进展

2013年8月1日-2012年8月15日：对嘧霉胺敏感和抗性菌株的选定、活化、转接。

2013年8月20日-2013年9月10日：查找基因序列，设计引物。

2013年9月15日-2013年10月15日：提取dna、pcr克隆、测序比对