芽孢杆菌B3菌株Rap-Phr系统的功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

芽孢杆菌属(bacillus)细菌的一些种，如枯草芽孢杆菌(b. subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(b. amyloliquefaciens)等，是一类重要的植物根围促生细菌。这类细菌能产生多种生防活性物质，如抗菌、促生物质以及蛋白酶类等。芽孢杆菌还能产生抗逆性较强的芽孢，比较适合工业规模化生产。目前国内外已有很多商品化的芽孢杆菌制剂在农业生产中使用，并取得了良好的防病和增产效果，但由于生防活性物质产量低，迄今应用面积仍然受到限制。因此，研究芽孢杆菌生防活性物质的合成调控机理，能为利用基因工程手段提高活性物质产量，开发高效芽孢杆菌生防制剂提供理论依据。

双组分系统(two-component systems,tcss) 是芽孢杆菌调控基因表达的最主要途径。该系统感应外界环境不同信号，调控相关基因表达，形成各种生物学性状，产生大量的活性物质[1-3]。双组分系统由组氨酸激酶和应答调节子组成。组氨酸激酶感受外界信号后自动磷酸化，然后将磷酸基团转移到应答调节子上，磷酸化的应答调节子进一步调控各种基因的表达[4]。研究表明，芽孢杆菌的双组分系统，能调控抗菌物质和外泌蛋白酶的合成[5,6]，能调控感受态和芽孢的形成[7,8]，还能调控生物膜和群集运动等性状的形成[9,10]。在芽孢杆菌杆菌中还存在一类特别的rap-phr系统(aspartyl phosphatase-regulator)，这个系统能通过作用靶标于双组分系统，进而调控各种基因的表达。因此，rap-phr系统是的芽孢杆菌调控网络的重要组成部分。目前，针对生防细菌的调控网络，利用基因工程进行改造，是提高活性物质产量最为有效的方法[11]。

芽孢杆菌的rap-phr系统，由天冬氨酰磷酸酶(aspartyl phosphatase,rap)和磷酸酶调节子(phosphatase regulator,phr)组成。细胞质中的rap蛋白催化双组分系统中的应答调节子去磷酸化，或者与应答调节子相结合，从而抑制其活性。而未成熟的phr因子含有n-端信号肽，通过未知途径分泌到胞外，形成成熟的phr短肽。当环境中细胞密度过大时，phr被寡肽通透酶运回胞内，起到抑制rap蛋白活性的作用[8]。芽孢杆菌rap-phr多以操纵子的形式存在，共用一个启动子[12]。研究表明，有3个rap蛋白(c,f,h)能作用于coma/p双组份系统，使coma去磷酸化，或者与coma结合，抑制抗菌物质的合成和感受态的形成。有4个rap蛋白(a,b,e,h)能使spo0f/a双组分系统中的spo0f去磷酸化，从而抑制芽孢的形成。rapg则作用于degu/s双组分系统，从而抑制胞外蛋白酶的产生。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标和内容：

对解淀粉芽孢杆菌b3菌株的全基因组比较分析表明，该菌株存在4个与已报道的rap蛋白编码基因同源性较低的基因。本课题将研究这4个基因的生物学功能。拟现将这4个预测rap和rap-phr表达框，克隆到大肠杆菌芽孢杆菌穿梭载体上pmk3上。再将构建好的重组载体，转到枯草芽孢杆菌okb105中。最后，通过表型和基因表达水平研究这几个基因所调控的信号途径。该研究能为后期研究rap-phr的结构功能域提供研究材料。此项研究能为利用基因工程手段提高活性物质产量提供靶标基因。

拟解决的关键问题：

3. 研究的方法与方案

本研究拟采用的研究方法：

本项目采用细菌遗传学，分子生物学和生物信息学等方法，系统研究b3菌株4个rap-phr操纵子的功能。采用的主要技术手段包括基因的克隆、载体的构建、细菌的遗传操作、基因的表达、质谱鉴定技术等。

实验方案和技术路线：

4. 研究创新点

本项目以B3菌株的Rap-Phr系统为研究对象，该研究有助于揭示芽孢杆菌Rap-Phr系统调控生防活性物质合成的机制，以及确定Rap-Phr系统在调控网络中的作用。该研究能为利用基因工程技术改造调控网络，提高生防活性物质的产量，提供靶标基因。

5. 研究计划与进展

研究计划：

（1） 2013.8 构建rap和rap-phr表达载体

（2） 2013.9表达载体转入okb105菌株中，并验证。