1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
课题意义、国内外研究概况、应用前景:
拟南芥被广泛地认为是一个卓越的模式植物,然而它作为模式植物的应用存在许多局限性,如观察单子叶植物特殊的进程等。水稻为禾草基因组提供了功能模型,它是第一个被基因组测序的禾本科作物,有可利用的综合突变体集。然而水稻株型大且栽培条件要求高。因此,在温室大量种植水稻花费较大。玉米,拥有全基因组序列和广泛遗传学资源的一个可选模式禾本科作物,株型也较大。另一个考虑就是温带禾本科品种的生理与水稻和玉米的生理有许多分歧,而热带作物产生了进化,温带作物需要一个更特殊的基因组和生物学模型。从2001年开始,短柄草发展成为一个禾本科实验的基因组模型来研究生物学问题。像拟南芥一样,短柄草体型小(20cm),生长周期短(2-3个月),基因组小(约272mb),自花授粉,而且能在简单的条件下生长。与小麦族植物一样具有二倍体(2n=10)、四倍体(2n=20)、六倍体(2n=30),可以作为一种新型的禾草模式植物。随着二倍体短柄草bd21基因组测序的完成大大促进了短柄草成为模式植物的进程。但二穗短柄草的转基因研究仍然较为薄弱,农杆菌介导法是最主要的植物转化方法,具有转化效率高、转移片段明确、整合拷贝数低特点。本研究致力于建立农杆菌介导的二穗短柄草t-dna突变体的构建,为短柄草基因工程的研究奠定良好基础。
短柄草基因组测序已经完成,大约272mb,拥有最小的禾本科基因组,短柄草有紧凑的、低的反转录转座子含量(23.3%)和dna转座子(4.6%)的基因组。目前已建立了两个不同品系的几个短柄草文库,包括bac文库。最大的bac文库是以bd21的基因组为原材料,覆盖率是全基因组的56倍,被用作参照基因组。另一个10倍的基因组覆盖率的bac文库,是以bd3-1为材料创造的。五个国家(美国、英国、中国、韩国、加拿大)的七个实验室目前正在创建t-dna突变体,而这些突变体将被整合进基因组浏览器中进行鉴定和排序,最终目的是创造足够的t-dna突变体,如此便能提高找到特殊基因的插入系的可能性。
2. 研究的基本内容和问题
目标与内容:农杆菌介导的二穗短柄草T-DNA突变体的构建
拟解决的关键问题:农杆菌介导下如何高效构建二穗短柄草T-DNA突变体
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线:
1.外植体的取材和消毒取开花后14天幼穗去外稃,在超净台中灭菌,用70%乙醇消毒5min,用无菌水清洗3-4次,再用2.5%次氯酸钠浸泡8min,无菌水冲洗5-6次。
2.胚性愈伤的产生在超净台中解剖镜下剥取幼胚,盾片朝上置于诱导培养基上,25度恒温暗培养4周。4周后将胚性愈伤移至新的诱导培养基中进行继代,一周后侵染用。
4. 研究创新点
农杆菌介导法是最主要的植物转化方法,具有转化效率高、转移片段明确、整合拷贝数低等特点。
利用此方法可高效构建二穗短柄草T-DNA突变体。
5. 研究计划与进展
2013.9.1 Bd21二穗短柄草催芽2013.9.3-2013.9.19 春化Bd21短柄草2013.9.20 Bd21短柄草从培养皿中移至花盆2013.10.23 始穗2013.11.2 开花2013.11.16-2013.12.10脱粒、播胚、LS培养基培养2013.12.2 第一次LS诱导培养2014.1.10-2014.2.10 脱粒、播胚、LS培养基诱导培养2014.2.10-2014.4.10农杆菌侵染,进行遗传转化2014.4.15幼苗鉴定
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