禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性相关基因Msy1的功能解析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

小麦赤霉病（fusaruim head blight of wheat）是一种世界各地均有发生的流行性病害。多发生在穗期多雨、气候潮湿地区。在我国，长江中下游冬麦区和东北春麦区发生最严重，长江上游冬麦区和华南冬麦区也经常发生，近年来，北方冬麦区、黄河平原冬麦区及北方春麦区等局部地区，尤其是灌区也发生较严重。随着地球气候的变暖以及轮作和免耕等耕作制度的变化，小麦赤霉病已经成为我国小麦生产中最重要的病害之一。小麦赤霉病发生后一般可减产10%～20%，严重时达80%～90%，甚至颗粒无收。病麦粒中含有脱氧腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,don），玉蜀黍赤霉烯酮（zearalenone,zen）等多种对人、畜有害的毒素，人、畜误食后可致发热、呕吐、腹泻等症状，怀孕母畜中毒后可引起流产。在我国其病原菌主要为禾谷镰孢菌(fusarium graminearum schwein),有性态为玉蜀黍赤霉(gibberella zeae (schewein) retch.)。

对小麦赤霉病的防治，长期以来由于缺乏有效的抗病品种，主要采用多菌灵、苯来特、甲基托布津等苯并咪唑类杀菌剂在小麦扬花期进行喷雾防治。但是，自1992年在浙江海宁市小麦病穗上检测到世界首例禾谷镰孢菌抗药性菌株以来，在江、浙、沪等地进行了连年抗药性检测，发现抗药性病原菌群体比例迅速上升，抗药性病原菌分布范围不断扩大，目前，华东地区已因抗药性而面临着多菌灵等现有杀菌剂防治赤霉病失败的危险。如何继续控制小麦赤霉病，尤其是控制多菌灵抗药性赤霉病的流行危害已成为广大科技工作者和种植者面临的重大课题。

氰烯菌酯（2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯，试验号：js399-19）是由国家南方农药创制中心江苏基地最新合成的一种对镰孢菌具有较高活性的化合物，特别是对禾谷镰孢菌（fusarium graminearum）菌丝生长具有强烈的抑制活性，田间也具有良好的防效。但是在离体条件下，通过紫外诱变和药剂驯化，禾谷镰孢菌对氰烯菌酯较易产生抗药性，且大部分抗药性菌株都属于中等抗性水平（mr）或高等抗性水平（hr），抗性菌株的适合度并无明显下降，禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的室内抗药性具有高等至中等风险。陈雨等研究发现在田间出现抗药性之前研究禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性机制，对科学制定该杀菌剂的应用策略和检测技术具有重要意义。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标： 以高抗菌株Y2021A为供试菌株，通过对禾谷镰孢菌甲硫氨酸合成酶基因FgMsy1（FGSG_10825）进行敲除，测定敲除体对氰烯菌酯的敏感性来验证其是否与禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性相关。同时，研究敲除体的表型变化，探索其对禾谷镰孢菌的生长有何影响。二、研究内容：1.构建甲硫氨酸合成酶基因的敲除载体；2.利用同源双交换法对禾谷镰孢菌的MSY1基因进行敲除；3.测定敲除体对氰烯菌酯的敏感性；4.研究敲除体的生物学功能变化情况（包括菌丝生长，孢子形态，田间致病力，产毒情况）；5.构建各敲除突变体的回复突变体，测定其生物学功能以及对氰烯菌酯的敏感性以及各种生物学功能变化情况。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法、技术路线：

1.甲硫氨酸合成酶基因基因（fgmsy1）的敲除：

通过融合pcr（double-joint pcr）将所敲基因的上下游各1kb，及双筛片段（3.5kb）融合，并利用巢式引物扩增完整载体。利用禾谷镰孢菌peg介导的原生质体转化技术，获得基因敲除突变转化子，并进行转化子的验证，获得敲除突变体。

4. 研究创新点

S-腺苷甲硫氨酸是广泛存在于生物体内的重要代谢中间产物，在体内参与众多生物化学反应。在体内，甲硫氨酸合成酶催化ATP和甲硫氨酸（met）形成s-腺苷甲硫氨酸。前期研究发现，用EC90（0.5μg/mL）浓度的氰烯菌酯处理野生敏感菌株2021和JS399-19HR菌株Y2021A 12h，同时以不加药剂作为对照。通过禾谷镰孢菌蛋白质双向电泳图谱分析，禾谷镰孢菌甲硫氨酸合成酶Msy1表达量发生显著变化，而抗药性菌株未发生显著变化。因此，本研究通过对Msy1进行敲除，验证Msy1是否与氰烯菌酯抗药性相关，同时分析该基因在禾谷镰孢菌中的功能。

5. 研究计划与进展

2013年89月： 构建fgmsy1的敲除载体；

2013年911月： 以菌株y2021a为供试菌株敲除这两个基因,获得敲除突体；

2013年12月－2014年3月： 补充完成试验，整理结果，撰写论文。