过量表达Decapping protein 2(Dcp2)mRNA脱帽蛋白对TSWV复制的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus,tswv)是布尼亚病毒科(bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(tospovirus)的典型成员。tswv寄主范围广，可侵染35科900多种植物，在世界上多个国家和地区广泛分布，侵染烟草、大豆、番茄、花生、辣椒、莴苣和菊花、凤仙花等多种花卉后可产生严重危害甚至绝产，目前已成为全世界10种危害性最大的植物病毒之一[1]。

目前，番茄斑萎病毒的致病机理还处于研究阶段。明确tswv的致病机理，对该种病害的防治有极其重要的意义。

作为专性细胞内病原物，病毒的编码能力有限。病毒的rna必须高度复制并借用寄主翻译装置，同时还要避免被寄主降解。此外，病毒的不同rna部分也必须保持稳定，包括基因组、抗性基因组和mrna。经过突变和选择，病毒已经演化出了复杂的策略来保护他们的5末端，进而防止被核酸外切酶降解，同时促进自身翻译。如一类病毒在细胞核内通过切割内源性加帽装置（例如，反转录病毒）进行复制，而在细胞质中复制的病毒不能用此方法。这类细胞质病毒自己编码加帽装置并产生类似内源性mrna的mrna（例如，弹状病毒）。一类病毒通过共价结合一个蛋白到5末端，来保护5末端防止其被宿主核酸外切酶标定而降解。另外有一类病毒通过抓帽机制来保护其5末端。所谓的抓帽机制，也就是说，病毒用自身编码的核酸内切酶切割宿主mrna的5末端帽子结构，进而形成原始物，形成的原始物被由依赖于病毒rna的rna聚合酶用来合成病毒的mrna。番茄斑萎病毒从属的布尼亚病毒科就是通过抓帽机制合成自身的mrna[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标

通过构建dcp2的过量表达载体，转入农杆菌gv3101。按设计浸润本氏烟植株。浸润24h后，摩擦接种tswv新鲜毒源，按时间梯度收集接种叶做western检测，从而验证dcp2对tswv复制的影响。dcp2的过量表达，预期干预tswv的复制。

2、研究内容

3. 研究的方法与方案

1、研究方案和步骤

（1）本氏烟总RNA提取：按试剂盒说明书提取本氏烟总RNA；

（2）反转录合成cDNA：以PV506为引物，本氏烟总RNA为模板，PCR反转录得到cDNA，纯化回收，保存待用；

（3）构建DCP2模板：取1.5ulcDNA为模板，以PV505PV506为引物，Primestare扩增NbDCP2（1000bp），NbDCP2加A，20ul体系，70℃处理20min，与pGEM-T载体连接，4℃过夜。转化，用M13/FPV506筛选阳性克隆，得到pGEM-T-NbDCP2-1000bp模板；

（4）构建过量表达载体pCXSN-NbDCP2：以pGEM-T-NbDCP2-1000bp为模板，稀释50倍，以PV505PV506为引物，Primestare扩增NbDCP2（1000bp），加A配成20ul体系，70℃处理20min，与pCXSN-T-XcmI连接，4℃过夜。转化，用XT307PV506筛选阳性克隆，得到pCXSN-NbDCP2-1000bp。测序正确后，转农杆菌GV3101。

（5）浸润植株：农杆菌处理液处理后，OD调至0.6。按下表的设计每个实验处理注射3株本氏烟，每株分别浸润3个叶片，记作1，2，3，如右图。

（7）摩擦接种毒源：植株浸润24h后，进行摩擦接种。取0.35g新鲜毒源，用3.5mL0.01mMPB研磨，记作原浓度；稀释5倍；稀释10倍。按下表设计接种48h（第2天）后开始按3，2，1的顺序收集接种叶。

（8）Western检测：分别取0.25g叶片加入500ul1xPBS研磨，研磨后，10000rpm离心10min，取10ul上清上样进行检测。

（9）分析讨论实验结果，与沉默表达进行对比。整理资料。

2、技术路线

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3、可行性分析

（1）指导老师实验室已建立了相对成熟的植物病毒生物学、分子生物学、电镜技术等研究体系（包括病毒提纯、电镜负染观察、温室工作、载体构建、多抗血清制备、SDS-PAGE、WesternBlot等），因而本课题的实施在技术上是可行的。

（2）指导老师实验室对TSWV的研究已经积累很好的工作基础，已发表多篇论文，可为研究过量表达Dcp2对TSWV的复制影响中提供重要的研究经验。

（3）本项目依托单位为南京农业大学植物病理国家级重点学科单位，国家211工程重点建设学科单位，农业部植物病原生物研究所及农业部病虫监测与治理重点开放实验室，拥有先进的现代化仪器与设备，为开展本项目研究工作提供了良好的硬件条件。

4. 研究创新点

本课题有具体的科学问题、明确的研究主线和关键研究切入点，并具有新颖的科研思路和合理的技术路线。

利用现代分子生物学技术，多种动物负义链rna病毒已经成功建立了微小基因组复制和转录的反向遗传学体系，并且也对几个重要病毒的全基因组成功实现了拯救。而对于植物负义链rna病毒来说，目前还没有报道过一个成功的反向遗传学体系，而归属布尼亚科（bunyaviridae）的番茄斑萎病毒属（tospovirus）是一种寄主范围最广的植物病毒，在世界范围内每年对重要农作物造成直接经济损失达10亿美元，是全球主要的病毒病害之一。本课题着重研究mrna脱帽蛋白dcp2在过量表达时对tswv病毒复制的影响。

本课题与实验室其他项目结合，不仅可为研究番茄斑萎病毒的基因功能和致病分子机理提供一个重要的研究平台，同时也将利用基因工程操作技术开辟植物负义链rna病毒反向遗传学研究的新途径。

5. 研究计划与进展

2013年8月-2013年10月：构建过量表达载体pcxsn-nbdcp2；

2013年11月：本氏烟种植、浸润、摩擦接种病毒及接种叶回收western检测；

2013年12月-2014年3月：实验结果讨论总结，资料整理，撰写论文。