水稻白叶枯病菌gumM的基因克隆及其敲除体对噻枯唑的药敏性测定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义：

水稻白叶枯病（rice bacterial blight）是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种（xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的一种重要的细菌性病害。由于长期单一的使用杀菌剂噻枯唑进行防治，水稻白叶枯病菌抗药性的产生使噻枯唑防效大幅度下降。研究表明，水稻白叶枯对噻枯唑的离体抗性菌株其胞外多糖的产量比出发敏感菌株明显下降，为了研究胞外多糖基因gumm与水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性的关系，本项目拟以水稻白叶枯病菌为靶标生物，构建胞外多糖基因gumm的敲除载体，将gumm基因进行敲除，测定敲除体对噻枯唑的敏感性及其生物学特性。研究成果将为氰烯菌酯的安全和合理使用提供科学指导，为基于作用靶标的新农药分子合理设计提供理论依据。

国内外研究概况：

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

探明水稻白叶枯病菌胞外多糖基因gumm与白叶枯病菌对噻枯唑抗药性的关系。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

拟采取的研究方法和实验方案：

1、构建水稻白叶枯病菌gumI与gumM基因敲除载体。

（1） 克隆水稻黄单胞病菌的gumM的上下游片段各约500bp碱基，并且克隆上游片段两端分别含有BamHI与KpnI酶切位点，下游片段两端分别含有KpnI与SacI酶切位点。

（2） 分别用纯化试剂盒纯化克隆的四个片段。

（3） 分别用限制性内切酶BamHI与KpnI双酶切gumM的上游片段，用KpnI与SacI双酶切其下游片段，再用BamHI与SacI双酶切敲除载体pK18mobSacB，37℃恒温箱反应5-6小时，然后纯化没切产物。

（4） 用连接试剂盒连接gumM基因的上下臂及载体pK18mobSacB。

（5） 将连接产物45℃，50s热激转化进入大肠杆菌DH5a感受态中。

（6） 提取构建好的敲除载体备用。

2、制备水稻白叶枯感受态细胞。

（l）zj173在NA平板上28℃生长活化，将单菌落细胞接入20ml NB液体培养基中；

（2）28℃展荡培养(120rpm)24h至OD600=1.0，吸取2ml培养液转接入l00ml

新的NB液体培养基中28℃继续培养12一16h，至OD600=0.5一0.6左右；

（3）将菌液转至预先冷却的50ml灭菌的离心管中，冰上放置10min，冰上冷冻10min，使其停止生长；

（4）4℃，6000rpm离心10min收集菌体；

（5）收集的菌体细胞用10%的甘油(灭菌预冷)4℃，6000rpm离心10min洗涤三

次；

（6）最后的菌体细胞用lml l0%预冷的甘油定容，使感受体细胞浓度达到

108cf/ ml，感受体细胞分装为100ul/管，储存在-20℃(短期)或-70℃(长期)

下备用。

3、将gumM基因的敲除载体电机转化进入zj173感受态细胞中，进行同源双交换。

4、在含有Km的NAN的培养基上进行单交换，36 天后将获得的单交换子在NAN液体培养基中28℃展荡培养(120rpm)9h。然后涂布在NAS培养基中，进行双交换，最终长出的黄单胞有可能是回复成野生型，也可能敲除体，还需验证。

5、PCR验证敲除体，用gumM基因上游片段的上游引物与下游片段的下游引物进行PCR，得出缺少gumM基因的双交换子即为敲除体。

6、进行Southern杂交验证。

7、测定gumM敲除体的EC50和MIC值。

（1）用接种环挑取在NA平板培养24 h的病菌菌落，接种于NA培养液中振荡培养24 h（28℃，170 rpm）。将菌悬液用NA培养液稀释到浓度为10⁷cfu/mL后，取100 μL菌悬液分别加入25 mL含有不同噻枯唑浓度梯度的NA培养液中，振荡培养24h（28℃，170rpm）后取出，用浊度仪测定其浊度。根据浊度计算不同药剂浓度处理下对病原菌生长的抑制率，以药剂处理浓度的对数为X，抑制率对应的死亡机率值为Y，计算出毒力回归方程。根据毒力回归方程计算其EC₅₀值。以不加药为空白对照，每个处理重复三次。

（2）取5μl上述稀释的菌悬液滴在不同浓度噻枯唑的NA平板上，置于28℃培养72h后观察菌落的生长情况。能够使细菌完全不生长的最低药剂浓度即为MIC。

8、将gumM敲除体剪叶接种喷施300μg/ml噻枯唑处理的稻苗，15天后调查病斑长度，分析实验结果。

技术路线

1、构建gumM敲除载体

2、将敲除载体电击转化到zj175感受态细胞

3、在NAN Km的培养基中进行同源单交换

4、将单交换子涂布在NAS培养基上进行同源双交换

5、PCRgumM验证为敲除体

6、将敲除体进行southern杂交验证；离体测定噻枯唑EC50与MIC

7、活体测定噻枯唑药敏

可行性分析：

项目申请者所在实验室对水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性及作用机理的研究已经进行多年，积累了大量的实验技术和实验数据，为本项目研究奠定了坚实的基础。实验室基因敲除技术平台已建立完善，而水稻白叶枯病菌农药生物测定亦经验丰富，实验经费充足。所以，次项目能按计划完成。

4. 研究创新点

首次研究水稻白叶枯病菌胞外多糖基因与水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性的关系。

5. 研究计划与进展

2013.8.1-2013.8.10：构建gumm基因敲除载体；

2013.8.11-2013.8.20：敲除zj173的gumm基因并验证；

2013.8.21-2013.8.31：对敲除体进行southern杂交；