大豆疫霉PsPI3K3敲除转化子的获得及初步功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

卵菌( oomycete)是一类真核生物,寄主范围较广,能够在植物和动物上引起病害。其中疫霉属( phytophthora)病原菌有160余种,数量庞大,是一类重要植物病原菌,能够引起作物毁灭性病害^【1】。如致病疫霉( phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病,在19世纪中叶导致爱尔兰大饥馑,目前仍给全球农业生产造成每年约67亿美元的损失;大豆疫霉( phytophthora sojae)引起的大豆根腐病,平均每年给全世界大豆生产造成约10-20亿美元经济损失^【2】。由于对其致病机理缺乏了解,这限制了病害防控技术的发展。因此,对其致病机制的研究将有助于我们发掘有用的技术来控制病害的发生。

根据对大豆疫霉四个生理小种的测序和生物信息学分析，发现大豆疫霉基因组中编码了将近400个rxlr效应分子^[3]，这些效应分子可以通过rxlr motif与植物细胞膜上的pi3p结合，从而帮助其进入寄主细胞内发挥作用^[4]。pi3p是一种主要存在于细胞膜中的磷脂,能够帮助许多蛋白的结合。这其中有许多都涉及到蛋白在膜上的转运，并且常作为第二信使在许多原核细胞中参与多种不同的生理过程^[5]。目前研究发现,一些蛋白中的fyve功能域和ph功能域都能够与pi3p结合。pi3k的合成主要来自于一种广泛存在于真核生物中的磷脂酰激酶一pi3k (phosphoinositide 3-kinases)^【6】。但是pi3p在植物体内的含量是非常低的,要结合足够量的pi3p,病原物就必须靠自身来产生一部分pi3p。在这个过程中,大豆疫霉的pi3k起到了重要作用^[7]。

前期已有文献报道大豆疫霉中共有个5个pi3k，对大豆疫霉的pi3k家族鉴定和进化分析,发现其中包含2个真菌和植物中仅有的classⅢpi3k,另外还鉴定到了3个class i pi3k,但这3个class i pi3k和其中1个classⅢpi3k在序列及蛋白功能域上与哺乳动物中传统的class i及class Ⅲpi3k存在差异。而大豆疫霉中pi3k的这些独有特征,在其他非疲霉的卵菌中只有部分保守。同样通过dge (digital gene express)的数据对大豆疫霉中5个pi3k进行表达差异分析,发现其中4个都在侵染阶段上调表达,而其余的1个class iii pi3k尽管在侵染阶段下调表达,但在侵染除段仍然呈现出较高的表达量^[8-9]。以上结果表明，pi3k的表达在病原菌的致病过程中发挥着重要的作用。同样以往文章报道pi3k参与细胞自噬,在酵母中，自噬的形成和定位到pas（自噬体组装位点）需要pi3k复合体的参与。而自噬在植物对有毒活体和半活体营养型病原菌的基础抗性过程中的作用已经在相关研究中被分析报道^[10]及哺乳动物的先天免疫中自噬在保护细胞抵抗胞内病原菌过程中起了关键作用。而在卵菌中自噬对其致病性的影响仍需进一步分析研究。因此关于五个pi3k对大豆疫霉致病性的影响及它们在大豆疫霉侵染大豆过程中所发挥的作用及其作用机制是目前的研究热点。pi3k3与pi3k4、pi3k5同属于class i pi3k分支,相比于其他两个成员，pi3k3缺少pi3k_c2功能域，并且pi3k3在五个pi3k中表达量是最低的，所以pi3k3是否与pi3k4、pi3k5具有相同的功能活性仍然需要更多的实验验证。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

目前已知大豆疫霉中被鉴定到五个pi3k， dge数据分析五个pi3k中有四个在大豆疫霉中侵染阶段上调表达，有一个pi3k在侵染阶段下调表达。根据文献报道及以上结果可以推测大豆疫霉中pspi3k3参与大豆疫霉侵染寄主的过程。本研究针对一个classⅠ pspi3k3基因运用crispr/cas9技术成功获得其敲除转化子并初步对其生物学功能进行研究。

研究内容

3. 研究的方法与方案

1.1供试材料

本章实验所用大豆疫霉菌株p6497(已完成全基因组测序)是由brett m.tyler教授(美国俄勒冈州立大学)馈赠，由本实验室保存，菌株的长期保存是采用斜面的方式，保存在12℃的10%v8培养基中。

1.2常用培养基制备

1.2.1 v8培养基：

每100 ml 的进口v8果汁中加入1 g caco₃，充分搅拌至其完全溶解后，2500 rpm，离心10 min，上清用双层纱布过滤后用蒸馏水稀释10倍，分装，在121c下 高压灭菌20 min。固体培养基加入1.5%的琼脂。

1.2.2 npb培养基(豌豆营养培养基):

4. 研究创新点

利用CRISPR/Cas9技术获得大豆疫霉敲除转化子，初步明确PsPI3K3对大豆疫霉致病的影响。从而利于揭示病原菌的致病机制，可以为有效的病害防控策略提供新的思路及方向，对设计和改造抗病性有重要意义。

5. 研究计划与进展

2016.08-2016.09:构建crispr/cas9敲除转化所需载体；

2016.10-2017.01：peg介导的大豆疫霉原生质体转化及目的转化子的筛选与验证；

2017.02：pspi3k3阳性转化子的表现型检测