免疫受体蛋白Sw-5b与本氏烟MPKKK7-like的互作验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究背景　　番茄斑萎病毒 (tomato spotted wilt virus, tswv) 是植物多分体负义链 rna 病毒，属于布尼亚科 (bunyaviridae) 番茄斑萎病毒属 (tospovirus) 的典型成员。

tswv寄主范围广、发生严重且较难防控，是目前世界上最具破坏性的植物病毒之一，在全世界重要农业经济作物上造成了极为严重的经济损失。

到目前为止，没有有效的防控方法，而抗病基因在抗病毒过程中发挥重要作用，所以对抗病基因的研究显得十分紧迫[1]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：　　(1) 构建nbmpkkk7-like酵母双杂交、gst-pull down及免疫共沉淀相关载体；　　(2) 多种方法验证sw-5b与nbmpkkk7-like之间的互作。

研究内容：　　(1) 构建nbmpkkk7-like的瞬时表达载体p2300-nbmpkkk7-like-mcherry及酵母双杂交载体pgadt7-nbmpkkk7-like　　(2) 通过酵母双杂交、gst-pull down和免疫共沉淀三种方法对sw-5b与nbmpkkk7-like的互作进行验证。

拟解决的关键问题：nbmpkkk7-like是通过co-ip的方法筛选得到的与sw-5b互作的候选因子，其与sw-5b是否真的存在直接或间接的互作关系有待进一步的验证。

3. 研究的方法与方案

研究方法　　(1)采用分子克隆法构建nbmapkkk7的瞬时表达载体p2300-nbmpkkk7-like-mcherry；　　(2)采用分子克隆法构建nbmapkkk7的酵母双杂交载体pgadt7-nbmpkkk7-like；　　(3)采用酵母双杂交、gst-pull down、免疫共沉淀技术鉴定sw-5b与本氏烟mpkkk7-like蛋白之间的互作关系；技术路线（1）nbmpkkk7-like 的瞬时表达及酵母双杂交载体的构建；（2）①酵母双杂交验证nbmpkkk7-like 与sw-5b的互作；②gst-pull down 验证nbmpkkk7-like 与sw-5b的互作；③co-ip验证nbmpkkk7-like 与sw-5b的互作；（3）确定nbmpkkk7-like与sw-5b之间的互作关系。

实验方案　　(1) pcr扩增得到nbmpkkk7-like目标片段后利用酶切、连接的方法将其构建到植物瞬时表达载体p2300，测序正确后转化到农杆菌菌株gv3101，用于后续实验；　　(2) pcr扩增pcr扩增得到nbmpkkk7-like目标片段后利用酶切、连接的方法将其构建到酵母双杂交载体pgadt7，测序正确后用于后续实验；　　(3) 通过农杆菌浸润的方法将p2300-yfp-sw-5b与p2300-nbmpkkk7-like-mcherry共同导入到本氏烟叶片进行瞬时表达，24 h后采集叶片进行co-ip实验来验证二者的互作；　　(4) 通过酵母共转化的方法将pgadt7-nbmpkkk7-like与pgbt9-sw-5b共转化到酵母菌株y2h gold进行酵母双杂交实验来验证二者的互作；　　(5) 通过农杆菌浸润的方法在本氏烟叶片中瞬时表达nbmpkkk7-like-mcherry，采集叶片后提取植物总蛋白，与原核表达的gst-sw-5b进行gst-pull down实验来验证二者的互作。

可行性分析　　本实验室具备完整的分析蛋白互作的理论知识积累和技术积累。

4. 研究创新点

番茄免疫受体蛋白Sw-5b与NbMPKKK7-like蛋白之间的互作关系的确定可深入揭示Sw-5b发挥抗性作用的下游信号通路及其的抗性作用机制。

5. 研究计划与进展

研究计划　　2017.9-2018.1　 (1) 学习并掌握基因克隆法构建载体的技术；　 (2) 学习酵母双杂、co-ip相关实验流程；　 (3) 进行酵母双杂法验证目的蛋白之间互作关系的实验并得到初步结论；　 (4) 进行co-ip验证目的蛋白之间互作关系的实验并结合酵母双杂法的实验结果作对比分析；　 (5) 提交中期检查考核表。

　　2018.2-2018.4　　(1) 进行gst pull-down验证目的蛋白之间互作关系的实验并与之前的实验结果结合分析；　　(2) 阐明目的蛋白之间的互作关系；　　(3) 课题总结，提交总结报告。

预期研究成果　　(1) 学会基本的分子遗传操作技术；　　(2) 掌握分子生物学各项技术原理；　　(3) 掌握验证蛋白互作各项技术的操作体系；　(4) 明确sw-5b与nbmpkkk7-like之间的互作关系。